考察学とみ子
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ここはTs.Markerさんの専門のようですね。バイオインフォマティクスの分野ですからある程度は勉強しないと概要把握もできません。そこは初歩の教科書やユーチューブの入門授業で格闘して戴くとして、難所は以下ですよね。 >> we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. 先にも書いたようにHiSeq 2500を使ってマニュアル通りにシーケンスを行い、結果をSAMtools Mpileup とBCFtools で表示させたというわけです。その表示見本はTs.Markerさんのブログにあります。レター論文に記載されているNCBIに登録されているRNAデータを遠藤が解析したものと同じものを、誰にでも見れるようにTs.Makerさんが公開されている。これはRNAデータですが、松崎はDNA解析を行っているんです。もっとも桂報告書には妙な記載があるのですが、その問題は後回しです。 ここではwe identified SNPs from the aligned sequence data と書かれているとともに、We also identified reliable SNVs と書かれていて、SNPs以外のSNVsを見つけたと述べているわけです。 SNPsもSNVsも一塩基変異ですが、SNPsの方がより多くの人に共有されている変異で全体の1%以上に存在していればSNPsと定義されている。その根拠は病例での研究が中心ですから、ある程度の人が持っていないと研究の効率が悪いというような理由ですね。それ以外の一塩基変異はSNVsだということになる。 解凍した試料の細胞は沢山あって、その中の一部分の細胞を取り出してDNAを抽出し、それを裁断してもう一度標準配列に添わせて再配列させる。細胞の数だけ同じサイトのリード が積上がって来るわけです。一か所のサイトにいくつのリードが重なるかによって精度が変わる。それが the following criteria として羅列されている。 >> (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence. (1)はリードの重なりがカバレッジです。20本以上という意味です。20個分の細胞以上ということです。これは次世代シーケンサーの仕組みが関係していて、細胞の数はとてもたくさんの分なんですが、細胞の数だけリードがあるとは限らないんです。フローセルに大量のリードを流すんですがその時に大半は外に流されてしまうんです。捕まったリードだけがシーケンスされるんです。だから偶然に一つのサイト上に20本以下の場合もあるのですが、その場合は信頼性が低いので分析結果に採用されないということです。 (2)は(1)の条件を満たしているサイトで重なったリードの1/4がB6の標準塩基と異なっていたらSNVsとすると定義づけているわけです。
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