どちらも胚盤胞期のインナ―セルマスを取り出して培養したのがES細胞ですから、ntESと受精卵ESに作り方の違いはありません。受精卵ES細胞の樹立率はArticle Extended Data Figure 1-i,jのコントロールに示されているように、2N実験ですと32/52で62%の発生率で、内ドナー細胞が混じったキメラは21/52ですから40%です。2Nはリシピエントのインナーセルマスからだけでも生まれますからね。4Nの実験ではリシピエント側のインナーセルマスは胎生致死で生まれてきませんから発生したらドナーの胎児です。生まれて後死んだのを除くと11/50ですから22%の樹立率です。結構低い達成率です。
というわけで、本文の ********** After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
という結論の説明としてのサプリとしての以下の文章は本文との関連性が何も書かれていないのです。 ********** We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence.
最期です。 ********** Antibody staining of teratoma samples Paraffin sections were prepared from the paraffin block of the teratoma samples after slicing approximately 100 x 5 μm sections for DNA extraction and treated according to a standard protocol for immunostaining. Chick anti-GFP antibody (Abes, GFP-1020) was used at a 1/500 dilution.
PCR primers The sequences of the PCR primers used in this investigation are available upon request.
We thank N. Kondo and the Genome Network Analysis Support Facility (GeNAS) at the RIKEN Center for Life Science Technologies for WGS. We also thank T. Endo, H. Ohta, S. Hayashi, H. Kiyonari, S. Kuraku, C. Kishida, and Doug Sipp for their assistance. This investigation was financially supported by RIKEN.
次です。 ********** Quantitative PCR of teratoma samples Genomic DNA was extracted using a QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) from 10 to 20 sections 5µm thick that had been sliced out of paraffin blocks. Genomic DNA samples were prepared from the STAP cell teratoma block in duplicate (2.2 µg and 6.1 µg). Newly prepared solutions, PCR primers and apparatus were used for the second isolation. All PCR primers for quantitative PCR were designed to be less than 100 bp in length so that fragmented DNAs in the fixed samples were efficiently amplified. Quantitative PCR was performed with FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) in a TAKARA TP 860. The degree of PCR amplification was quantified relative to that of the Il2 gene as a standard using the ΔΔCt method. Initially, we detected gfp with two different primer sets to roughly estimate its relative copy number compared with two copies of the Il2 gene/genome, followed by the determination of the gfp transgene type using PCR primers that detect the junction between the Acrosin gene promoter (and the Oct4-promoter) and the gfp gene. The amplification efficiency of primer pairs for Acr-gfp and Oct4-gfp relative to that for Il2 gene was not quantified, but the copy number of Acr-gfp in FLS4 and Oct4-gfp in GLS13 relative to the Il2 gene coincided with the values determined by WGS (20–24 copies vs. approximately 28 copies, respectively), suggesting that the amplification efficiency of individual PCR primers was within a permissible range.
と、若いころにヨーロッパを乞食旅行してまわったのだけが自慢のヒッピーのなれの果てポンチタビナシマンジルチョン糞爺いを蹴りだしたところで、続きをやりましょう。もうその後は大したことが書かれてませんね。 ********** Detection of long deletions and duplications We used SVDetect with a "linking" option to find long deletions and duplications as potential signatures that can identify identical samples<6>. The detected candidates were filtered using "filtering" and "links2compare" options to obtain reliable structural changes and were manually inspected and validated by PCR and Sanger sequencing.
以下の本文にあるB6の3番、129の8番に存在する欠失の検出です。 >> these STAP cell lines shared two genomic characteristics with FES1, but not FES2; first, two chromosomal deletions (Fig. 1a) are present only in FES1 and all Acr/cag-GFP STAP stem-cell sublines, but not in the other cell lines examined, in the paternal Acr/cag-GFP mice (frozen stock in 2010), or in potential maternal 129 substrains available in Japan.
シャバダバ桂報告書の同じ叙述箇所で指摘したとおり、これはFES1はFLSに差し替えられているのですから当たり前の事実をいっているだけで、FES2にないのはこれが大田細胞のままだと指摘したところです。シャバダバ桂とアッポ松崎はFES1は2005年のものだという前提で2005年のFES1の遺伝子欠失が後から作られたFLS3,129/GFP ES,CTS1にある筈は無かろうという論理展開をしているつもりなんですが、FES1は先生がFLSにラベルをFES1としただけで、バカみたいな話になるのですから、先に証拠能力の検証が必要なのにそれを行ってない弱みから、これだけでは仄めかしには十分でないと思って、今度はSNPs解析から、培養変異の話にをすり替えた後に、何を証明したのでもないのに、suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.とたわけたことを書いているのです。 GLSの欠失も同じです。これは入れ替えです。
さあ、この時に定義されたSNVsは近交系マウスの登録SNPsサイトの塩基変異ではありませんよね。培養細胞の中の1/4に生じているSNPsサイト以外の他の場所に現れた一塩基変異です。培養変異ですね。これは培養期間の長さに比例して多くなるということが分かる。しかし、それが多いから細胞の時系列的先後は無論決まりませんよね。それにここにはそんな結論めいたことは何も書かれていない。ただ、SNVsをたくさん見付けたと述べているだけです。 本文に書かれていたこととどういう関係かは最後まで読まないと分かりませんね。 ********** Identification of gfp insertion sites We mapped the reads to gfp sequences and extracted mate-pairs for which only one end was mapped to the gfp sequence using BWA. The extracted reads were mapped to the human<→mouse> genome. We manually inspected the mate-pairs bridging between gfp and mouse genome sequences using IGV<5> and determined the exact positions of insertion sites supported by multiple mate-pairs.
ここはTs.Markerさんの専門のようですね。バイオインフォマティクスの分野ですからある程度は勉強しないと概要把握もできません。そこは初歩の教科書やユーチューブの入門授業で格闘して戴くとして、難所は以下ですよね。 >> we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags.
ここではwe identified SNPs from the aligned sequence data と書かれているとともに、We also identified reliable SNVs と書かれていて、SNPs以外のSNVsを見つけたと述べているわけです。 SNPsもSNVsも一塩基変異ですが、SNPsの方がより多くの人に共有されている変異で全体の1%以上に存在していればSNPsと定義されている。その根拠は病例での研究が中心ですから、ある程度の人が持っていないと研究の効率が悪いというような理由ですね。それ以外の一塩基変異はSNVsだということになる。
解凍した試料の細胞は沢山あって、その中の一部分の細胞を取り出してDNAを抽出し、それを裁断してもう一度標準配列に添わせて再配列させる。細胞の数だけ同じサイトのリード が積上がって来るわけです。一か所のサイトにいくつのリードが重なるかによって精度が変わる。それが the following criteria として羅列されている。 >> (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence.
素人には難所の場所です。 ********** Whole-genome sequencing and SNP identification We used the TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit for sequencing library construction using a standard protocol. The insert size of the STAP cell lysate sample is 350 bp and the other 14 samples are 550 bp each. We performed paired-end 150 bp sequencing for each DNA sample using 2 flow cells in the rapid-run mode of a HiSeq 2500 sequencer. We aligned paired-end sequence tags to the GRCm38 (mm10) mouse reference genome using BWA software4 (ver. 0.7.10) with “-n 0.02” option for the bwa aln command and “-a 2000000” option for the bwa sampe command. Raw data are available at DDBJ DRA (accession: DRA002862) (http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA002862). After filtering properly mapped tags and then removing PCR duplication with SAMtools (ver. 0.1.19), we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence. For comparison to 129/Sv SNPs, we used commonly called SNPs in 129P2/OlaHsd (EMBL ENA: ERP000034), 129S1/SvImJ (EMBL ENA: ERS076385), and 129S5SvEvBrd (EMBL ENA: ERP000036) but not called in C57BL/6NJ (EMBL ENA: ERS076384) provided by the Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/).
順番に検討していきましょう。 ********** Cell culture STAP stem cell lines (FLS3, 4, GLS1, 11, and AC129-1,2) and FI stem cells (CTS1, 11) were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 10% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol and 1000 U/ml LIF.FI stem cells were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 20% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol, 2 µg/ml heparin and 50 ng/ml human FGF4. The remaining cell lines were cultured using the 2I-LIF method3 with 10% FBS.
早速不正確な事を書いてますね。 ********* SUPPLEMENTARY INFORMATION doi:10.1038/nature15366
Supplementary Methods
Materials All samples examined in this investigation had been stored at the laboratories of the original papers’ authors1,2 , except for FES1, FES2, ntES1 and e<n>tES2 cells (given by H. Ohta) and Acr/cag-GFP mice (from the frozen embryonic stocks at the CDB).
サプリに進んでみましょう。まず全文です。 >> SUPPLEMENTARY INFORMATION doi:10.1038/nature15366
Supplementary Methods
Materials All samples examined in this investigation had been stored at the laboratories of the original papers’ authors1,2 , except for FES1, FES2, ntES1 and e<n>tES2 cells (given by H. Ohta) and Acr/cag-GFP mice (from the frozen embryonic stocks at the CDB).
Cell culture STAP stem cell lines (FLS3, 4, GLS1, 11, and AC129-1,2) and FI stem cells (CTS1, 11) were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 10% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol and 1000 U/ml LIF.FI stem cells were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 20% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol, 2 µg/ml heparin and 50 ng/ml human FGF4. The remaining cell lines were cultured using the 2I-LIF method3 with 10% FBS.
Whole-genome sequencing and SNP identification We used the TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit for sequencing library construction using a standard protocol. The insert size of the STAP cell lysate sample is 350 bp and the other 14 samples are 550 bp each. We performed paired-end 150 bp sequencing for each DNA sample using 2 flow cells in the rapid-run mode of a HiSeq 2500 sequencer. We aligned paired-end sequence tags to the GRCm38 (mm10) mouse reference genome using BWA software4 (ver. 0.7.10) with “-n 0.02” option for the bwa aln command and “-a 2000000” option for the bwa sampe command. Raw data are available at DDBJ DRA (accession: DRA002862) (http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA002862).
After filtering properly mapped tags and then removing PCR duplication with SAMtools (ver. 0.1.19), we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence. For comparison to 129/Sv SNPs, we used commonly called SNPs in 129P2/OlaHsd (EMBL ENA: ERP000034), 129S1/SvImJ (EMBL ENA: ERS076385), and 129S5SvEvBrd (EMBL ENA: ERP000036) but not called in C57BL/6NJ (EMBL ENA: ERS076384) provided by the Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/).
Identification of gfp insertion sites We mapped the reads to gfp sequences and extracted mate-pairs for which only one end was mapped to the gfp sequence using BWA. The extracted reads were mapped to the human<→mouse> genome. We manually inspected the mate-pairs bridging between gfp and mouse genome sequences using IGV<5> and determined the exact positions of insertion sites supported by multiple mate-pairs.
Detection of long deletions and duplications We used SVDetect with a "linking" option to find long deletions and duplications as potential signatures that can identify identical samples<6>. The detected candidates were filtered using "filtering" and "links2compare" options to obtain reliable structural changes and were manually inspected and validated by PCR and Sanger sequencing.
Quantitative PCR of teratoma samples Genomic DNA was extracted using a QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) from 10 to 20 sections 5µm thick that had been sliced out of paraffin blocks. Genomic DNA samples were prepared from the STAP cell teratoma block in duplicate (2.2 µg and 6.1 µg). Newly prepared solutions, PCR primers and apparatus were used for the second isolation. All PCR primers for quantitative PCR were designed to be less than 100 bp in length so that fragmented DNAs in the fixed samples were efficiently amplified. Quantitative PCR was performed with FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) in a TAKARA TP 860. The degree of PCR amplification was quantified relative to that of the Il2 gene as a standard using the ΔΔCt method. Initially, we detected gfp with two different primer sets to roughly estimate its relative copy number compared with two copies of the Il2 gene/genome, followed by the determination of the gfp transgene type using PCR primers that detect the junction between the Acrosin gene promoter (and the Oct4-promoter) and the gfp gene. The amplification efficiency of primer pairs for Acr-gfp and Oct4-gfp relative to that for Il2 gene was not quantified, but the copy number of Acr-gfp in FLS4 and Oct4-gfp in GLS13 relative to the Il2 gene coincided with the values determined by WGS (20–24 copies vs. approximately 28 copies, respectively), suggesting that the amplification efficiency of individual PCR primers was within a permissible range.
Antibody staining of teratoma samples Paraffin sections were prepared from the paraffin block of the teratoma samples after slicing approximately 100 x 5 μm sections for DNA extraction and treated according to a standard protocol for immunostaining. Chick anti-GFP antibody (Abes, GFP-1020) was used at a 1/500 dilution.
PCR primers The sequences of the PCR primers used in this investigation are available upon request.
We thank N. Kondo and the Genome Network Analysis Support Facility (GeNAS) at the RIKEN Center for Life Science Technologies for WGS. We also thank T. Endo, H. Ohta, S. Hayashi, H. Kiyonari, S. Kuraku, C. Kishida, and Doug Sipp for their assistance. This investigation was financially supported by RIKEN.
References
1. Obokata, H. et al. Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency. Nature 505, 641–647 (2014); retraction 511, 112 (2014). 2. Obokata, H. et al. Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Nature 505, 676–680 (2014); retraction 511, 112 (2014). 3. Ying, Q. L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519–523 (2008). 4. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows– Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754–1760 (2009). 5. Robinson, J. T. et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnol. 29, 24–26 (2011). 6. Zeitouni, B. et al. SVDetect: a tool to identify genomic structural variations from paired-end and mate-pair sequencing data. Bioinformatics 26, 1895–1896 (2010).
既述しましたが、細胞の培養変異によってどちらが培養期間が長いのかを調べる時はマウスなら25億塩基対のすべてを調べますね。どうせコンピューター比較です。結果が出るのを人は待っていればいいだけです。全解析していると言ってますから、次世代シーケンサーを使っています。先回りして書いておけばサプリにHiSeq 2500 sequencerが使われていることが記載されている。 どうして登録SNPsサイトだけを比較しているのかということです。全サイト数はSNPsサイト数の百倍のオーダーで存在している。この場合、全データの1%のサンプル調査は全体を代表しません。なぜならSNPsサイトは無作為ランダムに選ばれた場所ではないからです。機械ならこんなに簡単なことをどうしてやらないかというと、SNPsの話から繋げて培養変異に持ち込んでいて、その演繹論理の飛躍を誤魔化そうとしているからです。 古くに作られた細胞があって20回の継代が行われた後に凍結されていたとする。今作って5回の継代後に凍結された細胞があるとする。培養変異は継代の多さに比例している。多い方が後から作られたという理屈は小学生でも言わないでしょう。 しかし、彼らはなんと言っているか。 ③ Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, は事実ですね。しかし、 ④but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells. と言えますか。 その根拠はサプリにも書かれていませんよね。科学ではありません。129/GFP ESがFES1の置き忘れ細胞で無かったら彼らの推論は成立しませんから、そうであることを証明したがっていますが、事実でないことは証明できないから、それらしくレトリックしているのです。④の論理に根拠が書かれていない。シャバダバ桂とアッポ松崎は何も言ってないのです。しかし、何かが言われているかのようにレトリックしているだけです。それがsuggestingという言葉に現れている。 彼ら何も断定していない。仄めかしていることが嘘で、自分たちが嘘つきであることを指弾されるのを恐れているから、断定せずsuggestするだけなのだ。
つまり、 ②the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. という主張自体が全く厳密でないということです。そもそもこの文章は前の文章と何の関係もない主張を含んでいる。 比較していたのはFLS3,129/GFP ES,CTS1,FES1の4細胞なのに突然どうしてFES1とFES2の比較が出て来るのかという問題ですね。 これは大田氏が2005年の同時期に作製したという前提を置いているんですね。どうしてそのことを論理説明の中に入れないかと言うと、そう書くと<細胞の由来に関して何も調査していない>ということが話題に上って、この細胞に<証拠能力がない>ということの詮索に繋がるし、自分たちの悪事を指摘されるからです。作製年代は細胞リストに2005/12/7と書いているだけで、それがどうしてわかったかというと、ラベルに書かれていただけで、誰が書いたのかの証拠もない。誰がそう言っているかの説明情報は日経サイエンスにリークしているもので、自分たちは直接そんなことは言ってないよと言う、世間でもよく馬鹿な詐欺師たちが使う陳腐な手法ですね。こんな程度のアッポに騙されていたら厳しい資本主義競争社会で生き抜けるものじゃない。学者が如何に間抜けな世界でぬるま湯に浸っているかということですね。
そういう証拠能力のない二つの細胞のthe above three SNP clustersを取り除いた中には断片化したマウスコンタミ痕も残っているのですから共通部分を取り除いた1290SNPsはそれを含んでいることになって、全部がto have accumulated at or after establishment in 2005.ではないということになるのですし、だからこそここでも断定せずにare supposedと胡麻化しているのは一目ですよね。 こういうレトリックが使われていること自体に世間は犯意を直覚しますから専門知識とは無関係に怪しいという疑義が醸成されて、所詮は長い目で見れば天網恢恢疎にして漏らさずというところに帰結するのですが、ここには更なる欺瞞がありますよね。
まず最初に ①After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, と述べている。 どうしてそんなことをするのかの説明がないが、このthe above three SNP clustersは染色体の乗り換え交叉のあったところだということがあまりにはっきりしているから取り除いたわけですが、マウスコンタミ痕があからさまにこういう塊の所だけだとは限らないのですし、これはブルー領域、つまり岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕ですからこれがどこに飛び回っているのかはntESG1、G2の岡部B6では、同じ領域になく、全く違う領域にあることからも知られるように、染色体の乗り換え交叉によって岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕がどういう断片化を受けているのかは分かって無いのです。つまりthe above three SNP clusters以外の場所に細分化された断片が入っている可能性が高いということは、これら4細胞の大きなコンタミ部分を取り除いただけで、まだ数百万単位で存在している残りのSMPsサイトに岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕があり得るということになる。 コンタミ痕のあるサイトと無いサイトでは塩基は違っていて当たり前ですから、これを培養変異だと決めつけることはできないということになる。 根本的にこんな杜撰なやり方で何かを言えることはありません。
①After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, ②the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. ③ Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, ④but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.
の意味を問うことになる。
登録SNPsの塩基サイトは100万単位ですね。three SNP clusters reflecting parental heterogeneityを取り除いてもまだ100万単位のサイトが残されている。そこでFES1とFES2とを比較したら異なるサイトは1290サイトだったと言ってるわけです。<残りの百万単位のSNPsサイト-1290サイト=やっぱり百万単位のSNPsサイト>の塩基は登録塩基で一致していたということです。仮にその場所に培養変異が入っていたとしても、どちらも同じように変異していたということになるので、それは確率的に少ないわけです。
で、the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.ですから、この登録SNPsサイトの1290箇所の塩基変異は培養変異だと想定していることになる。
ここまでは2005年当時に129X1コロニーにあったことになっている<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>で、ピンク部分の話で、Extended Data Figure 1-b,cの1Mバイト図のレジェンドにdifferential SNP clusters (red rectangles) between FES1 and FES2とされているものです。
対してBCA報告論文がthree SNP clusters reflecting parental heterogeneityとしているのはブルー部分です。これは<2011年当時の岡部マウスコロニーにあった何らかの種類の129の飛び込み痕>です。これがExtended Data Figure 1-aのレジェンドにGenomic regions in which FES1 and FES2 ES cells have different SNP clusters in chromosomes (chromosomes 6, 11 and 12) are marked by red rectangles.とされている場所です。
********** >> After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
最期の④が、<After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded>と書かれている文章の中の< three SNP clusters reflecting parental heterogeneity>という言葉の意味で、レジェンドに示されている<red rectangles>の中のブルー領域の話なのです。
コメント
二言乞食孤児
又他所様の干場に登り、下着泥を再現中・・三つ子の魂・百歳まで忘れられず・・
哀れなるかな・・・
2023/04/09 URL 編集
二言乞食よ
けけけ。そうなの?こじたんの日記にはそう書いてあるのね(笑)。
と、日記にはかいておこう、あさだあめみずあめ。「溜息ブログ8日」
plus99%にまで立ちションベンを掛けられている・・・
2023/04/09 URL 編集
http://zscan4.livedoor.blog/archives/5171306.html
ちと釣りです。んじゃ。
2023/04/09 URL 編集
FLSは129とB6のF1です。これがICRのミトコンドリアのDNAを持っていたらntESだということになるわけです。
2023/04/09 URL 編集
①除核卵への体細胞核移植(クローン胚)→出生率1%
②自然胚→出生率ほぼ100%
①クローン胚胚盤胞期→インナーセルマス取り出し培養→増殖確認出来た株→キメラ実験→キメラ樹立株のみntES細胞として樹立確認
②自然胚胚盤胞期→インナーセルマス取り出し培養→増殖確認出来た株のみES細胞株として樹立確認
2023/04/09 URL 編集
二言孤児骸骨信女
嘲笑されるだけの人生が待っている。賽銭泥棒と下着泥棒の慣れの果てが、背中に彫った登り龍が、ミミズに化けた詐欺師と言う正体を自ら暴露している。雌鶏に食われる運命が待っている。
三条の大橋から身投げし、NYかサンフランシスコに漂流するヒッチハイクが待っている。憧れの同性婚が認められている都市だ。路上生活が待っているにせよ、セイの自由が待っている。縮んだチンチンを露呈させる自由がある、二言乞食よ・・・
2023/04/09 URL 編集
2023/04/09 URL 編集
先生は獣医学出身なので、その研究は畜産応用のために実際にクローン動物を作ることに主眼が置かれてきていて、その貢献に対する評価の高さは知られている通りです。クローン胚のもっと深いリプロクラムの仕込みを解明するという方向は今まで行ってこなかった。一人でやれることは限られていますからね。そこに小保方さんという何かやってくれそうな人が偶然飛び込んできたという事ですよね。自分も現役の研究者を降りて大学での後進の指導という教職につくことになっている。相撲でも野球でも現役引退というのは当人には寂しいものがありますよね。なにか、もう一仕事やれるんだけどなあという心残りもある。向こうに行って小保方さんと今度は本格的なクローン胚のリプロクラム原理の研究をしたいと思ったかも知れない。しかも、そう思ったからと言って何も悪いことでもない。
2023/04/09 URL 編集
①FLBのソートとは何か。
②ヘテロプラス三―の証明はできているか。
ntESはクローン胚から発生させた胚盤胞のインナーセルマスを取り出して培養したものです。クローン胚をそのまま発生させると1%程度が正常な個体になる。
対して受精卵ES細胞の元は自然に交配させた卵ですから、当たり前ですが、そのまま発生させているとほぼ100%正常な個体になる。
どちらも胚盤胞期のインナ―セルマスを取り出して培養したのがES細胞ですから、ntESと受精卵ESに作り方の違いはありません。受精卵ES細胞の樹立率はArticle Extended Data Figure 1-i,jのコントロールに示されているように、2N実験ですと32/52で62%の発生率で、内ドナー細胞が混じったキメラは21/52ですから40%です。2Nはリシピエントのインナーセルマスからだけでも生まれますからね。4Nの実験ではリシピエント側のインナーセルマスは胎生致死で生まれてきませんから発生したらドナーの胎児です。生まれて後死んだのを除くと11/50ですから22%の樹立率です。結構低い達成率です。
2023/04/09 URL 編集
>>ES細胞が混入したというのは説ではなく事実である。
スピン言辞ですね。BCA報告書タイトルと同じくES細胞の定義に先生の作成した小保方酸浴細胞核使用ntESも含まれ得るようにもレトリックされてますね。
学生のGOF ESはntESですが、リストの情報は関係者からの情報であって、科学的に細胞がES細胞であるかntESであるかを検査してはいないし、又、それは基本的には識別不可能だからなんですね。
またため息無駄口与太郎教授は、何に関して話していてるのかも意図的に曖昧にしてますよね。more scientific and academicな日本語書けないのかと訝る。学さんの事をとやかく言えるような日本語ではないですね。関係ない話題に小保方さんに関する虚偽の仄めかしを挿入しないように。気をつけんないと、その内吉良上野介になっちゃうよ。
2023/04/09 URL 編集
また自分のこと言ってるんだな。オタンチンのオタンコナス。わっはっは。
2023/04/09 URL 編集
一言ポンチタビナシ乞食坊主
下着泥め・・
もうお前が棲む処は何処にもない・・
賽銭泥め・・・
2023/04/09 URL 編集
はっはっは。馬鹿が。
2023/04/08 URL 編集
ショボクレ一言乞食坊主
大体お前の様な四流アマを呼び寄せたのは誰だ・? スピン屋としても四流。パンパスを穿いて駄々洩れ状態。お天道様も笑っている・・・
2023/04/08 URL 編集
マンジルチョンへ
ははははは。とうとう正体現わしたか。間抜け。
2023/04/08 URL 編集
セイヤへ
2023/04/08 URL 編集
セイヤ観音
一言骸骨信士の失言は、本人が余りにも愚かな存在だと気付いていない事に要因がある。在米ポスドクの様な一流の学者の前では、紛い物は紛い物に過ぎない事を、ガラス玉のルビーに過ぎない事を自覚すべきだ。
其の点、セイヤのお色気は本物だ。家宝にして床の間に飾り、夜な夜な可愛がりたいの一言に尽きる。おまけに賢い。48手など生まれ落ちた時から、精通している気配がする。嫁にするならセイヤ観音に尽きる・・・
2023/04/08 URL 編集
学さん
ペルドン氏の「お代官さま・・・」コメントは、本人ではなく、一言居士氏が書いています。
今回は、一言居士氏が投稿の際に凡ミスをしているので、接続情報を調べなくても分かりますが、学ブログの信用をなくする行為ですね。
>一言居士さんに楽しいでしょう?と言われても、当ブログはそう思いません。おちょくられているの感です。
おちょくっていると思いますね。次の発言(3月27日)からも分かります。
「違います。私はあなたの考え方や思いに対して違うと言ったことはない。仰ってることが事実と違うと言っている。例えば、小保方さんは男だと書いてあったら違うというのが当たり前で、自分はそう思わないと書くのは馬鹿です。」
ブログ主の主張をまるで理解しようとせず、自己主張ばかりで、学校の先生から「高い」の反対は?と聞かれ、皆が「低い」と正解する中、ひとり「高くない」が正解だと強引に主張しているようなもんだ。道徳感に欠ける。
その一言居士氏をペルドン氏が批判しているが、それに同意する。
一見、不道徳のようなペルドン氏は「擦った揉んだ」の喧嘩が好きなように見えるが、彼は〓〓を「擦った揉んだ」が好きなだけだ。
2023/04/08 URL 編集
一言乞食骸骨信士
墓穴を掘って泣きながら眠れ・・南無谷八幡大菩薩・・
セイヤの腿の付け根の青い薔薇観たい・・・
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
一言大法螺吹き骸骨信士
一言乞食坊主が、在米ポスドクに坊主頭にされ、丸裸にされ、ケツの穴に大根を突っ込まれたまま、大泣きして猫小屋に帰って行ったってさ・・・
2023/04/08 URL 編集
一言首無し骸骨・女性下着収集家
骸骨になっても、それ程女性下着に執着心があるなら、新品の女Tバックを無料で進呈したのに・・
ため息に懇願したら使用中を一枚プレゼントしてくれるだろう。その貴重な一枚は、僕が記念に貰って置こう。これは内証だ。知れたら万札数枚払えと吹っかけるに決まっるから・・・
2023/04/08 URL 編集
下着ヘチベルドン
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
一言骸骨信士下着泥
今交番の前を通ったら、お前の躰のコピーと盗品のコレクションの女性下着の山が張られていた。心当たりの方はお引き取り下さいとさ。
近く「学」さんのブログも出入り禁止になるな・・・
2023/04/08 URL 編集
私はこの存在しないF1の幹細胞こそ12/27Harukoテラトーマの上から先生が注射してしまった細胞だと見ている訳です。だから存在しないのだと。
そして、この細胞は私の仮説ではクローン胚からES化された後に樹立確認のためにキメラ胚に入れられて、12/28の4Nキメラ等となったが、この残りのキメラ胚から取り出した細胞がもう一度胚盤胞から取り出されて、このクムリナ文書の説明になっているのではないかという疑義があるわけです。
私は最初からこれは可能性の一つとして考えてはいたんですけどね。証拠がないから言いませんでした。その不満がリョーブさんやDORAさんやセイヤ氏なんかにもあるらしいということはとっくに気づいてましたが、警察をちゃんと入れて捜査しないといけませんよね。いつから山梨の研究所の所長兼務が決まったのかという問題と、任期が建物建設待ちで一年延長されたた事実との関係で、この最初のキメラ成功問題が絡んでいるのは、デイナの取材で、ヴァカンティ氏側のプロモーションの関係を疑う言葉を取材してますよね。
私のntES論では小保方酸浴細胞核使用ntEとの作製過程でそのキメラ樹立によるntESの樹立確認は必要ですが、そのキメラ胚からもう一度細胞塊を取り出す必要はありません。若しそれを以て幹細胞だとしようとしていたのなら、これは先生の捏造手続きということになるんですよね。
2023/04/08 URL 編集
>>
No. 2172 (2014/02/02 02:51) Cumulina
べさま コメントをありがとうございます。核移植を一番の専門にしているのに、核移植のいらない初期化方法を発表して、自分で自分の首を絞めている論文の関係者です。今回の小保方さんの発見はすごすぎたのかレフェリーに相手にしてもらえず、ずいぶん苦労しました。いまマスコミでリケジョとか違う方向で話題になっていますが、本当にすごい研究者で膨大な実験を徹夜続きで行いました。論文ですが、サプリにたくさんのデータが乗っていますが、それもほんの一部です。たとえば細胞の樹立がなかなかできず、STAP細胞を注入したキメラ胚を使って初めて樹立に成功したデータは、当初それだけで論文にするつもりでしっかりした表と解析を行っていたのですが、途中から直接簡単に樹立できるようになり、葬り去られました。実験中にどんどん発展していったのでしょうがないですが、STAP細胞の将来がすごく楽しみです。
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
ヘタレベルドンへ
2023/04/08 URL 編集
まず理研に残されたサンプルが樹立サンプルなら樹立数が異なっているし、打たれたナンバリングが正しいなら、実験数も違っている。
MTAでの4N実験は8個分行われて、樹立は4個ですが、理研に残されているサンプルはソート済が7個ある。ソートするのはキメラ胚に入れているので、取り出した時には2Nでも4Nでもリシピエント側のインナーセルマスと同時に取り出されて培養されるからですが、ドナー側にはGFPが入っているからそのGFPを指標に選別してドナー細胞だけを取り出して培養したということです。培養継代できたから樹立としてサンプル凍結されていると考えるのが普通ですが、増殖しなかった分も参考のために凍結したかも知れないのでその辺りは不明ですが、MTA側の8分の実験だとすると欠番のFLB-5がそれにあたりますかね。しかし、その場合2Nの実験数が変なんですね。
FLB-1と2は欠番です。そしてMTA側の実験個数は10個ですからまだ4個の欠番があることになり、FLS16-19であろうということになる。MTA側の樹立数は4個ですから欠番以外が4個残されていることになる。4N側の残され具合と整合してないですね。
この辺り何も調査されていないので分からないところです。このマウス背景を先生は何であると言ったか、或いは研究ノートに書いたかも調べられて無いし、遺伝子解析して「僕のマウス」だったのか、それとも岡部マウスとのF1だったのかも調査されていない。
2023/04/08 URL 編集
一言骸骨乞食
ため息の御尻を追いかけるのは、辞めた方が良い。直ぐ交番に駆け込むタイプだ・・・
2023/04/08 URL 編集
①FLBのソートとは何か。
②ヘテロプラス三―の証明はできているか。
まずは①から行きましょう。
FLBの理研に残されていたサンプルは以下です。
41番 FLB-3 sort 1本
42番 FLB-4 sort 1本
43番 FLB-6 sort 4N 2本
44番 FLB-7 sort 4N 2本
45番 FLB-8 sort 4N 2本
46番 FLB-9 sort 1本
47番 FLB-10 sort 1本
48番 FLB-12 sort 4N 2本
49番 FLB-13 sort 4N 2本
50番 FLB-14 sort 4N 2本
51番 FLB-15 sort 4N 2本
対して先生の事後MTA添付細胞リスト記載事項は以下です。
STAP-SC 2012年1月31日 129B6F1-GFP Chimera embryos x 7 樹立2 FLB1 to 8
*FLB:F1 Limphocyte Blastosyst
STAP-SC 2012年2月3日 129B6F1-GFP Chimera embryos x 3 樹立2
STAP-SC 2012年2月2日 129B6F1-GFP 4N chimera x 8 樹立4
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
この二つの問題をかまってちゃん乞食であるルの相手をしながら考えてみましょう。私はやられたらやり返すだけですからウクライナですね。あいつが先に手を出してくるのですからプーチンです。
2023/04/08 URL 編集
女房にも追い出され
ええっ、それお前の事じゃないか?
お前ずっと自分自身の事を言ってると思っていたが、アルツハイマーの無意識じゃなくて、ひょっとして自覚的に告白してる訳か?
2023/04/08 URL 編集
2023/04/08 URL 編集
一言乞食
神職出だって、町内の稲荷に棲みついているだけじゃないか。早起きも賽銭をくすねる為の早起きに過ぎない。ため息がお尻を振りながら歩く様を、遠くから恥骨を握って、見詰めているに過ぎない。
骸骨になってもその欲望は抑えきれないらしい。哀れなるかな哀れなるかな・・ポンチタビナシ乞食一言・・・
2023/04/08 URL 編集
私が提出した疑念を否定できない限りは「小保方さんがポトリ」を仄めかしたこの政府の正式報告書は虚偽記載文書だということになりますから、いずれ天網恢恢疎にして漏らさずという時期が来ることになるでしょう。それまでは私のブログの便所の壁に落書きされて居続けることになる。ここは今は誰も見てないが、既に実質5千人以上が覗いて行ってコピペしてる人もあるでしょうから、いずれお天道様は見てるという結果になっていくんですね。
ま、この学さんのコメント欄もため息ブログの自主閉鎖に伴って消去され、普通のブログに戻ることになるでしょうが、無論その時はルのコメントはため息ブログ同様アク禁でしょう。
ル、今の内だぞ、早くかかってこいや。
と、まあ、難問の方の話をすれば私のntES論自体には解明できてない部分があります。以前書きましたが小保方酸浴細胞の核をntESにするときに、まずクローン胚を胚盤胞にまで成長させて、その内部細胞塊を取り出してESを作り、それをキメラ胚に入れて樹立確認をするのですが、この2Nキメラ胚の内部細胞塊を取り出して又ES細胞に下から、先生は小保方さんの12/27テラトーマの上からそれを注射したということで、体細胞を切り出して接着したなどと間抜けたことを言った在米ポスドクならぬ在鮮スパイ野郎の鼻っ柱を叩き割ってやったのですが、しかし、以前にも言ったように、このキメラ胚からの二回目のES作りは通常のntESの作成手順には不要なんですよね。
2023/04/08 URL 編集
待っている間に、難問解きにチャレンジしましょう。
2023/04/08 URL 編集
我が国ではそういうのをとっちゃん坊やというな。ボードレールなんかは頭の禿げた子供達なんて言ってたかな。西鶴は知恵の浅瀬を渡る下々と言ったっけな。お前の祖国では機関銃の餌食なんて言ってたっけ。
まあお前の背乗りした足軽でも武士階級なので、1%の階級出身をその中で卑下しながら得意がってるようでは、本当に足軽の家の生まれで、特に誰に対して表明するわけでもない普通の方々に失礼で、過去を遡れば貴族階級出身の同様に何も世間対して表明するわけでもない普通の方々からは内心の失笑を買ってるということにも気づけまい。
お前が私から血反吐の出るまでぶん殴られ続けているのはお前のそういうチンケな差別意識だな。人は神の元に平等に生まれついているんだよ。神でなければお天様でもいいや。因みにいっとくが私は神職の家系筋だよ。俺様は優しい人間なんだ。
でも、暗頭來や暗頭打だからな。馬鹿にはこちらも馬鹿になって接する。相手が殴ってきたらその鼻っ柱を陥没させてやるのは快感だぜ。見ろ、お前のただ何でも逆を行ってればかしこいと人が思うと勘違いして味方しているプーチンがアングロサクソン人たちにボコボコにされて鼻血をだしている姿を。
世界にもお天道様は有るんだぜ。でも、現世に目に見えて存在しているのは人間だけだからな。神様でもないのに偉そうなことは言えないから、米国大統領もそんなことやめて、やめてと言いながら、プーチンの金玉蹴り上げている様子くらい、片方の目ん玉からポンチタビナシを垂らしているお前でももう一方の目でみえるだろうが。
今日は釣りの所為で腰痛が悪化しそうだから休んでるんで暇なんだぜ。何時でも掛かってこいや。くひひひひ。
2023/04/08 URL 編集
一言ホモ孤児
頭蓋骨は無くなり、骸骨にポンチタビナシをぶら下げ、夜這い専門に成らざるを得ない。
在米ポスドクに襤褸にされ、痛み蹴られ、禿尻尾を丸めて夜逃げしたのも、記憶がある。
お前の様な夜這い専門がしたり顔に、剽窃した英文でインキン田虫の金玉を飾っているのは、烏滸がましい限りだ。狸に騙されて肥溜めの風呂に浸かっているのが、分からない哀れさよ。そして何よりも臭い臭い臭い・・・
2023/04/07 URL 編集
頭蓋骨を齧り取られた糞金国出生成分背乗りマンジルチョン(ル)ンペンの遺骨
2023/04/07 URL 編集
頭蓋骨がない土座衛門信士
そろそろ学さんからも愛想疲れ・・屋根裏の干場に戻りたいが、太平洋を土座衛門じゃ、溜息にも骨を拾ってもらえない。ジワジワと死神の手が伸びてくる・・・
2023/04/07 URL 編集
ポンチタビナシの北鮮人へ
2023/04/07 URL 編集
一言骸骨乞食
2023/04/06 URL 編集
んじゃ。
2023/04/06 URL 編集
>>
(2)常染色体の SNPs も同様にして調査した。その結果、STAP 幹細胞 FLS3、FI 幹細 CTS1、および ES 細胞 FES1、FES2、ならびに小保方研ストック ES 細胞 129/GFP ESは、ほぼ 129 x 1/SvJmsSlcxC57BL/6NCrSlc の遺伝的背景を持つことが判明した。ただし、本来は全ての SNPs で 129 と C57BL/6 のヘテロ接合体になるべきと考えられたが、実際は、FES2 を除く 4 株では、調査した 99 か所中 4 か所において 129 由来のホモ接合体になっていた。このことは、これらの幹細胞を作製したマウス系統の遺伝的背景に不均一性があったため生じた可能性と、これら 4 か所において突然変異が生じた場合とがあることを示していた。実際、若山研で飼育されていたAcr-GFP/CAG-GFP マウス(遺伝的背景は C57BL/6)には、その遺伝的背景に不均一性が見られた( 3)NGS による解析結果 を参照)
「調査した 99 か所中 4 か所において 129 由来のホモ接合体になっていた」と書かれている。DNAの全解析をして百万箇所単位の登録SNPsサイトを調べたのではなかったのか。それがBCA報告論文のExtended Data Figure 1-aではないのか。25億サイトを10メガ単位で区切ったのだから、250箇所に切り分けられている筈ですよね。
まず99というと残りの151サイトは登録SNPsの存在しないホワイトエリアなのか。そんなことはあり得ないでしょう。どうして99箇所なのだ。
しかも、その中のこれはブルー部分だけを言っているが、4か所というのは塊のはずですよね。99のスライスの中の4スライスではないですね。
本当に杜撰な報告書です。世界に対して恥をさらしてますね。みっともない。
2023/04/06 URL 編集
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After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
親の不均一性を反映する上記の3つのSNPクラスターを除外した後、FES1とFES2を区別する残りの1,290のSNP対立遺伝子は、2005年の確立時または確立後に蓄積したと考えられる。これらのSNPに関しては、STAP細胞株FLS3とCTS1および129 /GFP ES細胞はほぼ同一であるが、FES1とはわずかに異なり(これらの対立遺伝子の30%)、STAP細胞株FLSおよびCTSがFES1 ES細胞のサブストックに由来することを示唆している。
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という結論の説明としてのサプリとしての以下の文章は本文との関連性が何も書かれていないのです。
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We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence.
また、適切にマッピングされたタグをフィルタリングした後、SAMtools Mpileup を使用して、次の基準を満たす整列配列データからヘテロ接合対立遺伝子を含む信頼できるSNVを特定した。(1) 配列カバレッジ が20以上。 (2) B6参照配列とは異なる代替対立遺伝子をサポートしているリードが少なくとも 25% 。
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何も書かれていない、何も主張されていない、ただsuggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cellsと何の根拠もなく、無責任に仄めかされているだけなのです。
2023/04/06 URL 編集
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Antibody staining of teratoma samples
Paraffin sections were prepared from the paraffin block of the teratoma samples after slicing approximately 100 x 5 μm sections for DNA extraction and treated according to a standard protocol for immunostaining. Chick anti-GFP antibody (Abes, GFP-1020) was used at a 1/500 dilution.
PCR primers
The sequences of the PCR primers used in this investigation are available upon request.
We thank N. Kondo and the Genome Network Analysis Support Facility (GeNAS) at the RIKEN Center for Life Science Technologies for WGS. We also thank T. Endo, H. Ohta, S. Hayashi, H. Kiyonari, S. Kuraku, C. Kishida, and Doug Sipp for their assistance. This investigation was financially supported by RIKEN.
テラトーマサンプルの抗体染色
DNA抽出のために約100×5μmの切片をスライスした後、テラトーマサンプルのパラフィンブロックからパラフィン切片を調製し、免疫染色の標準プロトコルに従って処理した。ニワトリ抗GFP抗体 (Abes、GFP-1020) を1/500希釈で使用した。
PCRプライマー
この調査で使用されたPCRプライマーの配列は要請があれば提供できる。
WGSに関して、N. Kondoと理化学研究所生命科学研究センターのゲノム ネットワーク解析支援施設 (GeNAS) に感謝する。 また、T. Endo、H. Ohta、S. Hayashi、H. Kiyonari、S. Kuraku、C. Kishida、および Doug Sippの支援に感謝する。 この調査は理化学研究所によって財政支援された。
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清成さんは丹羽さんの再現実験でキメラ胚へのナイフ切り分けインジェクションを手伝った人ですね。今は理研のユニットリーダーになっている。何もしてない人の名前を遠藤や大田や林GDやの悪党の中に混ぜ入れるなよな。
2023/04/06 URL 編集
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Quantitative PCR of teratoma samples
Genomic DNA was extracted using a QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) from 10 to 20 sections 5µm thick that had been sliced out of paraffin blocks. Genomic DNA samples were prepared from the STAP cell teratoma block in duplicate (2.2 µg and 6.1 µg). Newly prepared solutions, PCR primers and apparatus were used for the second isolation. All PCR primers for quantitative PCR were designed to be less than 100 bp in length so that fragmented DNAs in the fixed samples were efficiently amplified. Quantitative PCR was performed with FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) in a TAKARA TP 860. The degree of PCR amplification was quantified relative to that of the Il2 gene as a standard using the ΔΔCt method. Initially, we detected gfp with two different primer sets to roughly estimate its relative copy number compared with two copies of the Il2 gene/genome, followed by the determination of the gfp transgene type using PCR primers that detect the junction between the Acrosin gene promoter (and the Oct4-promoter) and the gfp gene. The amplification efficiency of primer pairs for Acr-gfp and Oct4-gfp relative to that for Il2 gene was not quantified, but the copy number of Acr-gfp in FLS4 and Oct4-gfp in GLS13 relative to the Il2 gene coincided with the values determined by WGS (20–24 copies vs. approximately 28 copies, respectively), suggesting that the amplification efficiency of individual PCR primers was within a permissible range.
テラトーマサンプルの定量PCR
パラフィンブロックから切り出された厚さ5μmの10から20の切片からQIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue kit(Qiagen)を使用して、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAサンプルはSTAP細胞テラトーマブロックから二回分(2.2μgと6.1μg)調製した 。新しく調製した溶液、PCRプライマー、および装置を 2 回目の分離に使用した。定量PCR用のすべてのPCRプライマーは、固定サンプル中の断片化されたDNAが効率的に増幅されるように、長さが100bp未満になるように設計されている。定量PCRは、TAKARA TP 860でFastStart Universal SYBR Green Master Mix(Roche)を使用して、実施された。PCR増幅の程度は、ΔΔCt法を使用して、標準としてIl2遺伝子の発現量と比較して定量化された。最初に、2つの異なるプライマーセットを使用してgfpを検出し、Il2遺伝子/ゲノムの2つのコピーと比較して相対的なコピー数を概算し、続いて、アクロシン遺伝子プロモーター( および Oct4 プロモーター)とgfp 遺伝子の間の接合部を検出するPCRプライマーを使用してgfp導入遺伝子の種類を決定した。Il2遺伝子に対するAcr-gfpとOct4-gfpのプライマーペアの増幅効率は定量化されていないが、 Il2遺伝子に対するFLS4のAcr-gfpとGLS13のOct4-gfpのコピー数は、 WGS によって決定された値 (それぞれ 20 ~ 24コピー対約28コピー)と一致し、個々のPCRプライマーの増幅効率が許容範囲内であることを示唆している。
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まずこのテラトーマの解析時に使われたパラフィンプロックに小保方さんが名付けているのは「CD45 カルス テラトーマlike」です。これを桂報告書(スライド)はパラフィンブロック「CD45 カルス テラトーマ」としてlikeの文字を消している。
小保方さんがlikeの文字を入れたのは無論ヴァカンティ足場を使ったからですが、ティシュー論文と博論でもB6を使っていて、この通常のプロトコルでのテラトーマは出来ないことが分かっていたので、ヴァカンティ足場に培養液を含ませた足場毎埋納して、テラトーマを作ったが、それはESのようにそのまま皮下に注射したもので無く、栄養剤を含ませた足場はインヴィトロの三胚葉分化実験に継続して組織内に癒着するという中間的な作り方なので、テラトーマlike と名づけていたので、この12/27Harukoの実験もB6マウスだったから、先生はキメラが出来たとは言っているがGOFマウスの酸浴細胞をそのままヴァカンティ足場の埋納法で作り、通常のプロトコルでの実験は精巣へのインジェクションで確認しようとしていたものです。
ドナー細胞はGOFマウスで小保方さんはそれ以外は使えません。F1なら先生に作ってもらわなければいけないが、小保方さんは休日出勤して、先生の知らない間に作製した後に渡米した。小保方さんが大田ESでこの実験を捏造していたのなら、若山さんはF1マウスを小保方さんに渡していたことになるが、小保方さんがGOFマウスしか使えない状態で大田ESで捏造することはないわけです。
作成当時は何があったのかは知られていませんが、アクロシンが出たと松崎が言った時には、先生は自分もF1を渡したと言わなければならないですし、小保方さんがドナーマウスとしてGOFマウスしか使えなかったと知っていたら、テラトーマの捏造犯は小保方さんではありえないと証言しなければなりませんよね。
でもどちらもしなかった。自分が小保方さんの実験の上から作成したばかりの幹細胞を注射したからです。キメラが出来たと言っている以上テラトーマができなければ小保方さんが怪しむからです。リクルートのために山梨大での助手のポストを用意しているとプロポーズ出来るまで間の時間稼ぎの方便の嘘だったからです。
BCA報告書のテラトーマの解析グラフにはわずかながらOct4-GFPが検出されていたのをアルイミオウジ氏が指摘した。しばらくネットで騒がれた後に松崎はこのグラフをOct4-GFPの全くないものに差し替えたのです。小保方さんがドナー細胞にGOFマウスを使っていたことを隠したかったので、同じ理由で、サンプルラベルに小保方さんが書いていたlikeという言葉を消していたのです。
そして、体細胞を切り出したなどとそれがリシピエントマウスであるヌードマウスのDNAであるかも確認せずに、GFPがないからドナーの体細胞だと言ったのです。仮にこれがICRマウスだとしたら2Nキメラ胚のリシピエントマウスの内部細胞塊由来ES細胞がテラトーマ形成したのだということが判明してしまったことでしょう。だから調べなかったのだ。
悪党です。
2023/04/06 URL 編集
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Detection of long deletions and duplications
We used SVDetect with a "linking" option to find long deletions and duplications as potential signatures that can identify identical samples<6>. The detected candidates were filtered using "filtering" and "links2compare" options to obtain reliable structural changes and were manually inspected and validated by PCR and Sanger sequencing.
長い欠失と重複の検出
識別すべきサンプルを識別できる潜在的特徴である長い欠失と重複を見つけるために、「linking」オプションを指定したSVDetectを使用した<6>。検出された候補は、信頼性できる構造変化を捉えるために、「filtering」および「links2compare」オプションを使用してフィルー処理され、PCR およびサンガーシーケンスによって手動で検査検証された。
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以下の本文にあるB6の3番、129の8番に存在する欠失の検出です。
>>
these STAP cell lines shared two genomic characteristics with FES1, but not FES2; first, two chromosomal deletions (Fig. 1a) are present only in FES1 and all Acr/cag-GFP STAP stem-cell sublines, but not in the other cell lines examined, in the paternal Acr/cag-GFP mice (frozen stock in 2010), or in potential maternal 129 substrains available in Japan.
シャバダバ桂報告書の同じ叙述箇所で指摘したとおり、これはFES1はFLSに差し替えられているのですから当たり前の事実をいっているだけで、FES2にないのはこれが大田細胞のままだと指摘したところです。シャバダバ桂とアッポ松崎はFES1は2005年のものだという前提で2005年のFES1の遺伝子欠失が後から作られたFLS3,129/GFP ES,CTS1にある筈は無かろうという論理展開をしているつもりなんですが、FES1は先生がFLSにラベルをFES1としただけで、バカみたいな話になるのですから、先に証拠能力の検証が必要なのにそれを行ってない弱みから、これだけでは仄めかしには十分でないと思って、今度はSNPs解析から、培養変異の話にをすり替えた後に、何を証明したのでもないのに、suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.とたわけたことを書いているのです。
GLSの欠失も同じです。これは入れ替えです。
2023/04/06 URL 編集
2023/04/06 URL 編集
一言土座衛門
魚の餌を一緒に昼飯に食べているらしいな。長くはないらしいから遅く短く生きてくれ。
さて、北朝鮮と無理難題を吹き掛けているが、最新のDNA調査でユダヤ系と判明した。ため息も同系らしい。出身地と姓名がユダヤ系。
日本古代史が面白くなってきた。一言乞食とは関係がない話になる。そもそもStapに無理矢理顔を突っ込んで来て、他人様の物乾しで魚を釣るとは、矢張り詐欺師の系統らしい。stapの偽の系図が魅力的なのだろう。
ドンブラコドンブラコと太平洋を頭蓋骨を失った骸骨が流されていく・・・
2023/04/06 URL 編集
2023/04/06 URL 編集
本文に書かれていたこととどういう関係かは最後まで読まないと分かりませんね。
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Identification of gfp insertion sites
We mapped the reads to gfp sequences and extracted mate-pairs for which only one end was mapped to the gfp sequence using BWA. The extracted reads were mapped to the human<→mouse> genome. We manually inspected the mate-pairs bridging between gfp and mouse genome sequences using IGV<5> and determined the exact positions of insertion sites supported by multiple mate-pairs.
gfp挿入部位の同定
リードをgfpシーケンスにマッピングし、BWAを使用して片端のみがgfpシーケンスにマッピングされたメイトペアを抽出した。抽出されたリードはヒト(→マウス)ゲノムにマッピングされた。IGV<5>を使用して、gfp とマウスのゲノム配列をつなぐメイトペアを手動で検査し、複数のメイトペアによってサポートされる挿入部位の正確な位置を決定した。
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ヒトゲノムとマウスゲノムを間違えている。嫌々仕事だから不注意になるんです。BCA報告論文の文責は松崎ですが筆頭著者は別の研究者です。内心嫌々書いているということが伺えるんですね。
行っていることはGFPの人工遺伝子の位置を探すことで、この挿入遺伝子は標準配列より長くなるわけですから、リードの双方向から探索してこの延長箇所を見つけるということです。
2023/04/06 URL 編集
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we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags.
先にも書いたようにHiSeq 2500を使ってマニュアル通りにシーケンスを行い、結果をSAMtools Mpileup とBCFtools で表示させたというわけです。その表示見本はTs.Markerさんのブログにあります。レター論文に記載されているNCBIに登録されているRNAデータを遠藤が解析したものと同じものを、誰にでも見れるようにTs.Makerさんが公開されている。これはRNAデータですが、松崎はDNA解析を行っているんです。もっとも桂報告書には妙な記載があるのですが、その問題は後回しです。
ここではwe identified SNPs from the aligned sequence data と書かれているとともに、We also identified reliable SNVs と書かれていて、SNPs以外のSNVsを見つけたと述べているわけです。
SNPsもSNVsも一塩基変異ですが、SNPsの方がより多くの人に共有されている変異で全体の1%以上に存在していればSNPsと定義されている。その根拠は病例での研究が中心ですから、ある程度の人が持っていないと研究の効率が悪いというような理由ですね。それ以外の一塩基変異はSNVsだということになる。
解凍した試料の細胞は沢山あって、その中の一部分の細胞を取り出してDNAを抽出し、それを裁断してもう一度標準配列に添わせて再配列させる。細胞の数だけ同じサイトのリード が積上がって来るわけです。一か所のサイトにいくつのリードが重なるかによって精度が変わる。それが the following criteria として羅列されている。
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(1) Sequence coverage > 20.
(2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence.
(1)はリードの重なりがカバレッジです。20本以上という意味です。20個分の細胞以上ということです。これは次世代シーケンサーの仕組みが関係していて、細胞の数はとてもたくさんの分なんですが、細胞の数だけリードがあるとは限らないんです。フローセルに大量のリードを流すんですがその時に大半は外に流されてしまうんです。捕まったリードだけがシーケンスされるんです。だから偶然に一つのサイト上に20本以下の場合もあるのですが、その場合は信頼性が低いので分析結果に採用されないということです。
(2)は(1)の条件を満たしているサイトで重なったリードの1/4がB6の標準塩基と異なっていたらSNVsとすると定義づけているわけです。
2023/04/06 URL 編集
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Whole-genome sequencing and SNP identification
We used the TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit for sequencing library construction using a standard protocol. The insert size of the STAP cell lysate sample is 350 bp and the other 14 samples are 550 bp each. We performed paired-end 150 bp sequencing for each DNA sample using 2 flow cells in the rapid-run mode of a HiSeq 2500 sequencer. We aligned paired-end sequence tags to the GRCm38 (mm10) mouse reference genome using BWA software4 (ver. 0.7.10) with “-n 0.02” option for the bwa aln command and “-a 2000000” option for the bwa sampe command. Raw data are available at DDBJ DRA (accession: DRA002862) (http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA002862).
After filtering properly mapped tags and then removing PCR duplication with SAMtools (ver. 0.1.19), we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence. For comparison to 129/Sv SNPs, we used commonly called SNPs in 129P2/OlaHsd (EMBL ENA: ERP000034), 129S1/SvImJ (EMBL ENA: ERS076385), and 129S5SvEvBrd (EMBL ENA: ERP000036) but not called in C57BL/6NJ (EMBL ENA: ERS076384) provided by the Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/).
全ゲノムシーケンシングとSNP同定
TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit を使用し、標準プロトコルを使用したシーケンスライブラリの構築を行った。STAP細胞溶液サンプルの挿入サイズは350bpで、他の14サンプルはそれぞれ550bpである。HiSeq 2500シーケンサーのラピッドランモードで2つのフローセルを使用し、各DNAサンプルに対してペアエンド150bpシーケンスを実行した。bwa aln コマンドの「-n 0.02」オプションと bwa sampe コマンドの「-a 2000000」オプションで、BWAソフトウェア4 (ver. 0.7.10) を使用して、ペアエンド シーケンス タグを GRCm38 (mm10) マウス参照ゲノムに整列させた。 生データは DDBJ DRA (アクセッション: DRA002862) で入手できる。(http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA002862)
適切にマッピングされたタグをフィルタリングし、SAMtools (ver. 0.1.19) で PCR 重複を除去した後、SAMtools Mpileup と BCFtools (ver. 0.1.19) をデフォルト オプションで使用して、配列データからSNPを特定した。また、適切にマッピングされたタグをフィルタリングした後、SAMtools Mpileup を使用して、次の基準を満たす整列配列データからヘテロ接合対立遺伝子を含む信頼できるSNVを特定した。(1) 配列カバレッジ が20以上。 (2) B6参照配列とは異なる代替対立遺伝子をサポートしているリードが少なくとも 25% 。129/Sv SNPとの比較のために、129P2/OlaHsd (EMBL ENA: ERP000034)、129S1/SvImJ (EMBL ENA: ERS076385)、および 129S5SvEvBrd (EMBL ENA: ERP000036) で共通に呼ばれるSNPを使用したが、Wellcome Trust Sanger Institute(http://www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/) 提供のC57BL/6NJ では呼ばれていない ( EMBL ENA: ERS076384) 。
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難所ですよね。
2023/04/06 URL 編集
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Cell culture
STAP stem cell lines (FLS3, 4, GLS1, 11, and AC129-1,2) and FI stem cells (CTS1, 11) were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 10% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol and 1000 U/ml LIF.FI stem cells were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 20% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol, 2 µg/ml heparin and 50 ng/ml human FGF4. The remaining cell lines were cultured using the 2I-LIF method3 with 10% FBS.
細胞培養
STAP幹細胞株 (FLS3,4,GLS1,11,とAC129-1,2)および FI 幹細胞 (CTS1,11)を、10% FCS、1x ピルビン酸ナトリウム、1x 非必須アミノ酸、10^-4 M 2-メルカプトエタノール、および 1000 U/mlのLIFを添加したGMEM中のマイトマイシンCで処理したマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞と共に培養した。FI 幹細胞を、20% FCS、1x ピルビン酸ナトリウム、1x 非必須アミノ酸、10^-4 M 2-メルカプトエタノール、2 µg/ml ヘパリン、および 50 ng/ml ヒト FGF4を添加したGMEM中のマイトマイシンCで処理したマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞と共に培養した。残りの細胞株は、10% FBS を含む 2I-LIF メソッド 3 を使用して培養した。
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培養液の詳細はど素人なので分からないが、STAP幹細胞もFI幹細胞も論文のプロトコルに書かれているようにフィーダー細胞との共培養です。小保方さんの酸浴蛍光細胞は培養液の中で泳がせているガラス底に接着させない非接着培養です。ここに先生から貰った培養液を入れてもほとんど増殖しなかったと『あの日』に書いています。
丹羽さんはこのフィーダー培地はESやTS用の倍他であると書いている。STAP細胞は小保方さんの手を離れて若山さんの手によってES (ntES)培地に入れられたのです。すると増殖し、更にそれをTS倍他に入れたらTS-Llikeな細胞になったと論文に書かれているのですが、丹羽さんは小保方さんの酸浴細胞と自分たちが小保方さんのアドバイスで作成できた蛍光細胞を論文通りの培地に入れたが増殖せず死滅して行ったと報告しているのです。
ここではっきりと、「小保方さんがポトリ」か「先生の別実験」なのかが分かれるところですから、キメラや幹細胞が出来た原因を作った犯人は、事故がありえず、成功させようと捏造する第三者もない以上、二人の内のどちらかなんです。
先生はどうしてフィーダー培地にしたのかというところに私の小保方酸浴細胞核使用ntES実験仮説があるんですね。分かってフィーダー培地にしているんですね。別の実験なんです。
これだけの検証をしている松崎がそれに気づかない筈はありません。単なるアッポと言われている内はいいが、意図的に違法に他人を陥れた犯人とされると困ることになるでしょう。しかし、そこはバックが付いているということです。こんな破廉恥なことを一介の学者にできる筈がありませんよね。違法天下りをしていた文科驢馬省ですよね。
因みに (FLS3, 4, GLS1, 11, and AC129-1,2) にFLS T1,T2が抜けている。杜撰な仕事ですね。しかし、私もため息ブログ自主閉鎖に向けて意図的に嫌味だらけに書いていますが、こんな仕事したい学者なんていませんよね。シャバダバ桂もアッポ松崎も多分そんなに悪い人ではないんですよね。心に一片の同情心はありますね。しかし、このままこういう官僚腐敗の一端を見せられて、しかもまだ言い続けているのかという怒りは、本当は古びて既得権益でボロボロになり、日本を斜陽国家にさせつつある官僚体質に向けられているんですがね。
2023/04/06 URL 編集
一般企業でこんな杜撰で不正確な報告書を書いていたら上司に突き返されるでしょう。もっとまじめ仕事しろと怒鳴られるのが関の山です。民間企業は競争原理で、社会に有害であったり無能であったりする企業は長期的にはライバル企業に売り上げを取られて倒産させられるのですから、組織内の各自は与えられた仕事を的確にこなすのが義務で、そうしないと他の社員たちと家族の生存をも危うくするわけです。
親方日の丸のぬるま湯体質の伺われるところです。これは民間での淘汰と違って、国家間の競争で敗れる原因になるんですね。プーチン政権を見てたら誰にでも分かる。
2023/04/06 URL 編集
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SUPPLEMENTARY INFORMATION doi:10.1038/nature15366
Supplementary Methods
Materials
All samples examined in this investigation had been stored at the laboratories of the original papers’ authors1,2 , except for FES1, FES2, ntES1 and e<n>tES2 cells (given by H. Ohta) and Acr/cag-GFP mice (from the frozen embryonic stocks at the CDB).
補足情報doi:10.1038 / nature15366
補足手技
試料
この調査で調べたすべてのサンプルは、(H. 太田氏によって提供された) FES1,FES2,ntES1,およびntES2 細胞と(CDBの凍結胚由来在庫である)Acr/cag-GFPマウスを除いて、原論文<1,2>の著者の研究室に保管されていたものである。
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文字の誤植はいいとして、解析されたサンプルは以下です。
①STAP -stem GLS1
②GOF ES
③STAP -stem AC129-1
④129B6F1 GFP ES-6
⑤STAP chip-seq control
⑥STAP -stem FLS3
⑦129/GFP ES
⑧FI-SC CTS1
⑨FES1 ES
⑩FES2 ES
⑪ntESG1
⑫ntESG2
⑬GOF mouse
⑭129 cag-GFP mouse
⑮B6 cag-GFP mouse
小保方研にストックされていた細胞は①②③④⑥⑦⑧で、⑤はGRASにあったとされているだけで、証拠提示はない。⑨⑩⑪⑫は大田ESとされるものだが論文の細胞2株は提出されていず、運搬経由の詳細も明らかにされていないが、Ooboeさんが書かれているようにパートナー氏はある程度の調査をされている。
>>
★FES1、ntESG1は山梨若山研から取り寄せ
★FES2,ntESG2は若山研、以外の別の所から取り寄せました。
というのが理研広報の回答。
>>
しかし、東北大、東大はパトナーにこれら4サンプルは、まとめて、山梨若山研から取り寄せたと文書で回答されているのですから、ならば理研も、山梨若山研からこの4サンプルまとめて取り寄せました、と、パトナーに回答するのが普通となるところ
という疑義が残されている。
⑬はCDBのもの。⑭⑮は「僕のマウス」であるなら理研には無く先生の提供です。
2023/04/06 URL 編集
サプリに進んでみましょう。まず全文です。
>>
SUPPLEMENTARY INFORMATION doi:10.1038/nature15366
Supplementary Methods
Materials
All samples examined in this investigation had been stored at the laboratories of the original papers’ authors1,2 , except for FES1, FES2, ntES1 and e<n>tES2 cells (given by H. Ohta) and Acr/cag-GFP mice (from the frozen embryonic stocks at the CDB).
Cell culture
STAP stem cell lines (FLS3, 4, GLS1, 11, and AC129-1,2) and FI stem cells (CTS1, 11) were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 10% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol and 1000 U/ml LIF.FI stem cells were cultured with mouse embryonic fibroblast feeder cells treated with Mitomycin C in GMEM supplemented with 20% FCS, 1x sodium pyruvate, 1x non-essential amino acids, 10^-4 M 2-mercaptoethanol, 2 µg/ml heparin and 50 ng/ml human FGF4. The remaining cell lines were cultured using the 2I-LIF method3 with 10% FBS.
Whole-genome sequencing and SNP identification
We used the TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit for sequencing library construction using a standard protocol. The insert size of the STAP cell lysate sample is 350 bp and the other 14 samples are 550 bp each. We performed paired-end 150 bp sequencing for each DNA sample using 2 flow cells in the rapid-run mode of a HiSeq 2500 sequencer. We aligned paired-end sequence tags to the GRCm38 (mm10) mouse reference genome using BWA software4 (ver. 0.7.10) with “-n 0.02” option for the bwa aln command and “-a 2000000” option for the bwa sampe command. Raw data are available at DDBJ DRA (accession: DRA002862) (http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA002862).
After filtering properly mapped tags and then removing PCR duplication with SAMtools (ver. 0.1.19), we identified SNPs from the aligned sequence data using SAMtools Mpileup and BCFtools (ver. 0.1.19) with default options. We also identified reliable SNVs including heterozygous alleles from aligned sequence data that satisfied the following criteria using SAMtools Mpileup after filtering the properly mapped tags. (1) Sequence coverage > 20. (2) At least 25% of reads supported alternative alleles that differed from the B6 reference sequence. For comparison to 129/Sv SNPs, we used commonly called SNPs in 129P2/OlaHsd (EMBL ENA: ERP000034), 129S1/SvImJ (EMBL ENA: ERS076385), and 129S5SvEvBrd (EMBL ENA: ERP000036) but not called in C57BL/6NJ (EMBL ENA: ERS076384) provided by the Wellcome Trust Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/).
Identification of gfp insertion sites
We mapped the reads to gfp sequences and extracted mate-pairs for which only one end was mapped to the gfp sequence using BWA. The extracted reads were mapped to the human<→mouse> genome. We manually inspected the mate-pairs bridging between gfp and mouse genome sequences using IGV<5> and determined the exact positions of insertion sites supported by multiple mate-pairs.
Detection of long deletions and duplications
We used SVDetect with a "linking" option to find long deletions and duplications as potential signatures that can identify identical samples<6>. The detected candidates were filtered using "filtering" and "links2compare" options to obtain reliable structural changes and were manually inspected and validated by PCR and Sanger sequencing.
Quantitative PCR of teratoma samples
Genomic DNA was extracted using a QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) from 10 to 20 sections 5µm thick that had been sliced out of paraffin blocks. Genomic DNA samples were prepared from the STAP cell teratoma block in duplicate (2.2 µg and 6.1 µg). Newly prepared solutions, PCR primers and apparatus were used for the second isolation. All PCR primers for quantitative PCR were designed to be less than 100 bp in length so that fragmented DNAs in the fixed samples were efficiently amplified. Quantitative PCR was performed with FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) in a TAKARA TP 860. The degree of PCR amplification was quantified relative to that of the Il2 gene as a standard using the ΔΔCt method. Initially, we detected gfp with two different primer sets to roughly estimate its relative copy number compared with two copies of the Il2 gene/genome, followed by the determination of the gfp transgene type using PCR primers that detect the junction between the Acrosin gene promoter (and the Oct4-promoter) and the gfp gene. The amplification efficiency of primer pairs for Acr-gfp and Oct4-gfp relative to that for Il2 gene was not quantified, but the copy number of Acr-gfp in FLS4 and Oct4-gfp in GLS13 relative to the Il2 gene coincided with the values determined by WGS (20–24 copies vs. approximately 28 copies, respectively), suggesting that the amplification efficiency of individual PCR primers was within a permissible range.
Antibody staining of teratoma samples
Paraffin sections were prepared from the paraffin block of the teratoma samples after slicing approximately 100 x 5 μm sections for DNA extraction and treated according to a standard protocol for immunostaining. Chick anti-GFP antibody (Abes, GFP-1020) was used at a 1/500 dilution.
PCR primers
The sequences of the PCR primers used in this investigation are available upon request.
We thank N. Kondo and the Genome Network Analysis Support Facility (GeNAS) at the RIKEN Center for Life Science Technologies for WGS. We also thank T. Endo, H. Ohta, S. Hayashi, H. Kiyonari, S. Kuraku, C. Kishida, and Doug Sipp for their assistance. This investigation was financially supported by RIKEN.
References
1. Obokata, H. et al. Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency. Nature 505, 641–647 (2014); retraction 511, 112 (2014).
2. Obokata, H. et al. Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Nature 505, 676–680 (2014); retraction 511, 112 (2014).
3. Ying, Q. L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519–523 (2008).
4. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows– Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754–1760 (2009).
5. Robinson, J. T. et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnol. 29, 24–26 (2011).
6. Zeitouni, B. et al. SVDetect: a tool to identify genomic structural variations from paired-end and mate-pair sequencing data. Bioinformatics 26, 1895–1896 (2010).
2023/04/06 URL 編集
釣りです。んじゃ。
2023/04/06 URL 編集
どうして登録SNPsサイトだけを比較しているのかということです。全サイト数はSNPsサイト数の百倍のオーダーで存在している。この場合、全データの1%のサンプル調査は全体を代表しません。なぜならSNPsサイトは無作為ランダムに選ばれた場所ではないからです。機械ならこんなに簡単なことをどうしてやらないかというと、SNPsの話から繋げて培養変異に持ち込んでいて、その演繹論理の飛躍を誤魔化そうとしているからです。
古くに作られた細胞があって20回の継代が行われた後に凍結されていたとする。今作って5回の継代後に凍結された細胞があるとする。培養変異は継代の多さに比例している。多い方が後から作られたという理屈は小学生でも言わないでしょう。
しかし、彼らはなんと言っているか。
③ Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical,
は事実ですね。しかし、
④but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
と言えますか。
その根拠はサプリにも書かれていませんよね。科学ではありません。129/GFP ESがFES1の置き忘れ細胞で無かったら彼らの推論は成立しませんから、そうであることを証明したがっていますが、事実でないことは証明できないから、それらしくレトリックしているのです。④の論理に根拠が書かれていない。シャバダバ桂とアッポ松崎は何も言ってないのです。しかし、何かが言われているかのようにレトリックしているだけです。それがsuggestingという言葉に現れている。
彼ら何も断定していない。仄めかしていることが嘘で、自分たちが嘘つきであることを指弾されるのを恐れているから、断定せずsuggestするだけなのだ。
2023/04/06 URL 編集
②the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.
という主張自体が全く厳密でないということです。そもそもこの文章は前の文章と何の関係もない主張を含んでいる。
比較していたのはFLS3,129/GFP ES,CTS1,FES1の4細胞なのに突然どうしてFES1とFES2の比較が出て来るのかという問題ですね。
これは大田氏が2005年の同時期に作製したという前提を置いているんですね。どうしてそのことを論理説明の中に入れないかと言うと、そう書くと<細胞の由来に関して何も調査していない>ということが話題に上って、この細胞に<証拠能力がない>ということの詮索に繋がるし、自分たちの悪事を指摘されるからです。作製年代は細胞リストに2005/12/7と書いているだけで、それがどうしてわかったかというと、ラベルに書かれていただけで、誰が書いたのかの証拠もない。誰がそう言っているかの説明情報は日経サイエンスにリークしているもので、自分たちは直接そんなことは言ってないよと言う、世間でもよく馬鹿な詐欺師たちが使う陳腐な手法ですね。こんな程度のアッポに騙されていたら厳しい資本主義競争社会で生き抜けるものじゃない。学者が如何に間抜けな世界でぬるま湯に浸っているかということですね。
そういう証拠能力のない二つの細胞のthe above three SNP clustersを取り除いた中には断片化したマウスコンタミ痕も残っているのですから共通部分を取り除いた1290SNPsはそれを含んでいることになって、全部がto have accumulated at or after establishment in 2005.ではないということになるのですし、だからこそここでも断定せずにare supposedと胡麻化しているのは一目ですよね。
こういうレトリックが使われていること自体に世間は犯意を直覚しますから専門知識とは無関係に怪しいという疑義が醸成されて、所詮は長い目で見れば天網恢恢疎にして漏らさずというところに帰結するのですが、ここには更なる欺瞞がありますよね。
2023/04/06 URL 編集
①After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded,
と述べている。
どうしてそんなことをするのかの説明がないが、このthe above three SNP clustersは染色体の乗り換え交叉のあったところだということがあまりにはっきりしているから取り除いたわけですが、マウスコンタミ痕があからさまにこういう塊の所だけだとは限らないのですし、これはブルー領域、つまり岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕ですからこれがどこに飛び回っているのかはntESG1、G2の岡部B6では、同じ領域になく、全く違う領域にあることからも知られるように、染色体の乗り換え交叉によって岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕がどういう断片化を受けているのかは分かって無いのです。つまりthe above three SNP clusters以外の場所に細分化された断片が入っている可能性が高いということは、これら4細胞の大きなコンタミ部分を取り除いただけで、まだ数百万単位で存在している残りのSMPsサイトに岡部B6に129の飛び込んだコンタミ痕があり得るということになる。
コンタミ痕のあるサイトと無いサイトでは塩基は違っていて当たり前ですから、これを培養変異だと決めつけることはできないということになる。
根本的にこんな杜撰なやり方で何かを言えることはありません。
2023/04/06 URL 編集
①After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded,
②the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.
③ Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical,
④but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
こんな論理運びをする人間が自然科学者だなんて誰が認めるでしょうかね。細胞の証拠能力を検証しない致命的な非常識をさらけ出している段階で既に無能がバレているところで、ただ、FLS3,129/GFP ES,CTS1,FES1の培養変異の数で培養された期間が分かるというトンデモ間抜けな論理です。
細胞の継代記録はどこにも公表されておらず、どのサンプルも凍解凍記録が知らされない中で、作製された年代だけが大まかに分かっているわけです。
FES1、2は2005年に作られ、その年に凍結された後に使われること無く2010年に京都大に持ち出され、2014年に解凍凍結をして山梨に送られたことが分かっているだけでその間の培養記録は何もない。
FLS3と129/GFP ESとCTS1は2012年に作られて1年後に小保方さんが米国に帰った時には全て凍結されていて、その間の培養記録は何もない。
129/GFP ESは我々は命名される前のFLSの小保方さん流の名づけだと見ているが、報告書は何の証拠も無くFES1の置き忘れ細胞だとしていて、仮にそうであるなら、このFES1のサブストックは2010年から2011年までは凍結されていたままで、小保方さんがそれを見つけてポトリしたのがFLS3とCTS1だとということになる。
こういう詳細な培養記録の無いサンプル同士を比較してその作製された時系列順を決めようとしているわけです。その手法は培養変異の数を比較するということです。
2023/04/06 URL 編集
2023/04/06 URL 編集
一言土座衛門
ハワイにもシンガポールにも行った事が無いので、遠泳観光をしているのだろう。半分骨になったから口が軽くなっていいるのか。
出が悪いというのは、お主の様な階級を言うのであって、加茂神社禰宜出身を語る言葉ではない・・・
2023/04/06 URL 編集
2023/04/05 URL 編集
Ooboeさん
ありますが此の頃新種の梅病が、日本にも大流行しているので、覗くだけで罹患する気分になってしまいます。罹患しても既に脳にたっしている一言孤児とは、良き相方と思われますので二人で続けられれば如何でしようか・?
善良なるパートナーには感染させない様に、御配慮を。普通二重に使用します・・・
2023/04/05 URL 編集
2023/04/05 URL 編集
擁護派は全員入れ替え説で説は一つです。代表的なのが和モガさん、DORAさん、パートナー氏ですね。私もそうです。パートナー氏は大田ESが理研松崎の手に入るまでのルートを追及された。入れ替え疑義を抱いていなかったらそんな調査はしません。
松崎が<GLS1~13=学生のntESであるGOF ES>と証明したから、学生のntESであるGOF ESの中身が入れ替えられているという演繹推論になるんです。事故コンタミがあり得ないという演繹推論と合わせると「小保方さんがポトリ」でなければ、先生の入れ替えなのです。
松崎はその学生が理研から持って出たであろう他のGOF ES株を調べようともしていませんよね。
学さんは「小保方さんがポトリ」なんてあり得ないと仰ってる。その直感は正しいと思いますね。他の要素からそんなことはあり得ないことが演繹できる。しかし、だからと言って、若山さんが入れ替えなんてしないだろうと、当時私も含めた一般人も考えました。誰か第三者の捏造だと思いたいんですね。私も最初に疑ったのは李ですね。でもパートナー氏は先生の記者会見を見て嘘をついていると直感された。そしてそのことをOoboeさんから聞かされたので、事実が判明するまでは証拠も無くそんなことはおっしゃらない方がよいとアドヴァイズしました。そしてそのことを了解された。私はまだその時は妙だなという直感はあったが、先生がそんなことをしているとは考えていなかったですから、結果だけ見るとパートナー氏の直感は正しかったのです。或いは変だなと感じてはいた私の直感のささやきも正しかったのだ。
『あの日』が出版されて初めてリクルートの件を知り、そして何故こんなことになったのかに突然気づきました。『あの日』の中の先生は親切心の塊の様に描かれていて、又、客観的な行為も第三者が見て親切以外の何物でもないですよね。それがどうしてああなっていくのか。
①博論のキメラ実験を手伝ってやった。
②震災で困っていた小保方さんを受け入れてやった。
③小保方さんを自分に渡して欲しいという要請がヴァカンティ氏に断られたにも関わらず、小保方さんの願いのGOFマウスを使った実験をさせるために隘路を使った客員受け入れまで西川氏の了承を取り付けて認めてやった。
ここまで先生に何の悪意があるでしょうかね。
④転機は酸浴細胞が光った時ですね。先生得意の顕微鏡知識からの判断でも自家蛍光でなく、ライブセル実験でESコンタミでもない細胞が、徐々に日を追って蛍光し始めた。因みにこの時に米国との間での共同研究協約書の締結が必要だと気づかなかったのは先生の管理上の落ち度です。西川さんもこの頃に知らされていなかったとしても、TCR再構成アドバイス前に論文を見せられているのですから気づかなかったのは西川さんの重大な落ち度でもあった。だから顧問をしていたが早くに辞任したのです。多分岸なんかが意見してるんじゃないですかね。最初は当然ですがずいぶん怒ってましたからね。ただ、後には文科驢馬省の尻尾きり方針に従ったということです。違法天下りしていたから早く収拾したかったのです。シャバダバ桂や、アッポ松崎にしたところで、文科驢馬省の指示に逆らうなんてこともできませんからね。松崎は最初に東北大の関係で仕掛けた側にいたのですが、これ幸いに文科省の指示に従ったわけです。自分で分析しているのですから事実を一番知っている人間です。
⑤その直後にキメラはできなかったのです。GOFでもF1でもできなかった。
ここまでなら誰でも分かることでしょう。
その後どうなったか。
2023/04/05 URL 編集
前コメントは
私、Ooboeでございます。
ネームが抜けてました。御免くださいませ。
2023/04/05 URL 編集
❝当ブログは、捏造説、入れ換え説などの非常識的な説を否定しています。❞
学さんの、優しい性善説の感性は、
尊いと思います
この感性は、日本の人々には無意識に自然ですね
そのように日々、普通に人様に接している事を
外国の方々は、感銘しておられるようです。
しかし、こと小保方StapのES事案は、
その学さん感性から、出発考察するには、
居士さん、和モガさん、パトナーの資料指摘
により、学さん考察は門が狭すぎてしまいます。
この学さん感性による考察も、一つの方向性であり
ます。しかし、今では、様々な故意なる所業の
結果可能性の情報資料も沢山存在しているのです、なので考察から、故意所業をはじめから排除するのは居士さん指摘にありますよう、
不意なる事故説の整合性は成り立たなくなるのではないでしょうか。
学さんの独特な感性による様々な考察には敬意を
抱かせて頂いて来ましたが、今後は、更に
資料情報のリアリズム考察の門戸も広げて
考察を深めて頂きたいと、願っております。
考察には、追いつけないかも知れませんが、、、
2023/04/05 URL 編集
ポンチタビナシ(ル)ンペン野郎へ
2023/04/05 URL 編集
一言土座衛門信士
さしずめその川が「三途の川」なのだろう・・ため息嬢が「ケケケケケ」と笑っておられます・・
赤長褌を鯉登にして土座衛門は頑張っている分けだ。ケケケケケケ・・・
2023/04/05 URL 編集
そんなに変わる培養変異なんてありませんね。1か所の変異がシャーレ一杯になるまでにどれだけの継代が必要か、又、10万か所の変異がシャーレ一杯になることは不可能でしょ。
細胞から取り出されたDNAは次世代シーケンサーに掛けられるとき細かいリードに裁断されて参照配列に添って沢山重ねられて並べられて行きますが、一サイトに一つだけ違う塩基があったらその細胞の中に1個の変異細胞があったということになります。この場合は全ての変異ではないのです。それに対してSNPSは全ての細胞で同じ塩基なんです。意図的なレトリックを使った誤魔化しですよね。
ちとランチ休憩です。
2023/04/05 URL 編集
After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.
の意味を問うことになる。
登録SNPsの塩基サイトは100万単位ですね。three SNP clusters reflecting parental heterogeneityを取り除いてもまだ100万単位のサイトが残されている。そこでFES1とFES2とを比較したら異なるサイトは1290サイトだったと言ってるわけです。<残りの百万単位のSNPsサイト-1290サイト=やっぱり百万単位のSNPsサイト>の塩基は登録塩基で一致していたということです。仮にその場所に培養変異が入っていたとしても、どちらも同じように変異していたということになるので、それは確率的に少ないわけです。
で、the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005.ですから、この登録SNPsサイトの1290箇所の塩基変異は培養変異だと想定していることになる。
まず培養変異なら、今DNA全解析している筈なのですから、登録SNPsサイトだけでなく、25億サイトの他の場所での培養変異も含めて比較すべきですよね。標準塩基配列はあって、近交系マウスの登録箇所が別途登録されている。全ての塩基配列は分かっていますから、培養変異の数をもって4細胞を比較するのなら<標準塩基配列+近交系マウス登録SNPs>で全部比較しなければならない。
2023/04/05 URL 編集
間抜け蝙蝠野郎へ
何時まで経っても成仏出来ず、かと言って下に流される事もなく、彷徨っている。
お前がな。馬鹿が。
2023/04/05 URL 編集
学さんへ
当ブログは、捏造説、入れ換え説などの非常識的な説を否定しています。
そうだとすると、報告書の<GLS1~13=学生のntESであるGOF ES>ということから、「小保方さんがポトリ」とため息与太郎教授と同じ主張をされていることになりますが、学さんはアンチでしたっけ?
それとも、小保方さんが間違って<学生のntESであるGOF ES>をコンタミさせてしまったとお考えですか? すると、2011/11/25先生が培養開始したGLも「小保方さんが間違ってポトリ」なんですね。この細胞は当の学生と小保方さんしか持ってませんよね。小保方さんは2度、GOFマウスの実験で事故コンタミさせたとお考えだということになりますね。
更に、2011/11/27の4Nキメラ時に小保方さんが間違ってコンタミさせたのはシャバダバ桂報告書によればFES1の置き忘れ細胞だと言っていることになるのですが、小保方さんがそんな他人の置き忘れ細胞を解凍したらそれだけで故意のコンタミ意図があると判断されるのですから、学さんは最初のキメラが出来た時に小保方さんが事故でコンタミさせた細胞は何だったのだとお考えですか?
その疑念は12/27Harukoテラトーマlikeにも及びますね。この時に小保方さんが事故でコンタミさせた細胞は置き忘れ細胞でなければ何だったとお考えなのですか?
そもそも小保方さんの細胞からキメラが出来たという、成功させるように捏造コンタミさせる赤の他人が何処にいるでしょうかね。成功を意図する捏造コンタミなら小保方さんか先生かに決まっているではありませんか。捏造意図でなく事故コンタミだとしたければすべての事例での説明が必要です。BDF1のキメラを作った時には、小保方さんはどの既存細胞を事故コンタミできるでしょうか。BDF1のntESサンプルは当時のラボに沢山ありましたが、小保方さんはそれを使う以外には先生にキメラを作らせることはできませんよね。これが小保方さんのコンタミなら、意図的な捏造コンタミに決まっているのです。事故で他人の細胞を解凍はできません。
擁護派なら入れ換え説を非常識などと根拠もなく独断することはできないはずです。
2023/04/05 URL 編集
-と一言乞食・腰巻と褌心中
2023/04/05 URL 編集
我々は分からないことは分からないと書けと主張しているので、仄めかすような虚偽報告はするなと、和モガさんや、パトナー氏は報告書の取り下げを申し入れたわけです。無論、拒絶されましたが。
2023/04/05 URL 編集
すると、大田氏から送られてきた細胞の背景は129B6F1Acr-CAG-GFP(ヘテロ)だ分かっているので、自分が小保方さんに渡した129B6F1Acr-CAG-GFP(ヘテロ)と同じであるから、一方だけを差し替えたのだという理由に到達できる。むしろ後の調査によってどちらも全く同じであった方がおかしいと考えたのではないか。
しかし、このことによって、
FES1にはあるがFES2には岡部B6の3番染色体の遺伝子欠失がない
ということの説明に齟齬が生じているのである。
桂報告書はこの欠失は<2010 年に若山研で受精卵凍結された Acr-GFP/CAG-GFP マウスにも存在しなかった>としているので2005年にもなかったということになり、4細胞に対して適用した同じ理屈で、FES1とFES2ともにマウス原因のこの欠失があってはおかしいという理屈になる。
FES1,2はntESではなく受精卵ESなのであるから、この欠失は、ES作成後の培養変異だということになるが、培養皿全体にこの欠失が広がるためには多くの継代が必要である。しかし、この細胞は作成後間もなく凍結されているのである。
2023/04/05 URL 編集
②先生が受け取ったFES1とFES2の内の前者をFLSに差し替えたという二つの可能性があるということになる。
然しながら、この後者は桂報告書の次の論理に従って否定されている。彼らによれば、なぜなら、別途FES1には
>>第 3 染色体の 5kb の欠失と第 8染色体の 17kb の欠失(第8染色体は129系統由来;第3染色体はB6系統由来)<6P>
があり、
>> 3 染色体の 5kb の欠失も、市販の B6 の亜系であるC57BL/6JJmsSlc (SLC)、C57BL/6NCrSlc (SLC)、C57BL/6J (Charles River)、C57BL/6NCrl (Charles River)、C57BL/6JJcl (CLEA)、C57BL/6NJcl (CLEA)のいずれにも存在しない。さらに、2010 年に若山研で受精卵凍結された Acr-GFP/CAG-GFP マウスにも存在しなかった。<7P>
とされているからである。特に2010年の岡部マウスになかったとされているのは一見その後の3細胞にもない筈だと聞こえるが、欠失が元のマウス原因だとは限らないどころか、ntESを作成するときにはまずはクローン胚に核を入れてリプログラムを促進させながら、卵割に進むのであるから、その途中で変異が入る可能性も考えなければならない。
更に129に至っては以下のような理由になっている。
>>市販の 129 の亜系である 129 x 1/SVJJmsSlc(SLC)と 129+Ter/SvJcl(CLEA)のいずれにも存在しない。<6,7P>
市販のマウスがその都度使われているのではなく、寧ろ自家繁殖させられているからこそマウスコンタミ痕があるのだから、市販のマウスと比較するなんてまつたく非合理な理由付けになっている。こんなので学者だと言ってるから世間からもの笑いされるのだ。
こんなことだから学校の生徒の身分から会社員になった時に学校で一体何を学んできたのだ、役に立たん奴らだと言われたら、先生たちが先生たちでしたからと答える奴らが増えるのだ。くひひひひ。
2023/04/05 URL 編集
対してBCA報告論文がthree SNP clusters reflecting parental heterogeneityとしているのはブルー部分です。これは<2011年当時の岡部マウスコロニーにあった何らかの種類の129の飛び込み痕>です。これがExtended Data Figure 1-aのレジェンドにGenomic regions in which FES1 and FES2 ES cells have different SNP clusters in chromosomes (chromosomes 6, 11 and 12) are marked by red rectangles.とされている場所です。
因みに1Mバイト図にある<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>はそれと分かるほどの大きなエリアなのに10Mバイト図に表示されていないという疑念は指摘済みです。
さてこのExtended Data Figure 1-aのred rectanglesで囲われてブール―部分を共有しているのは以下の細胞です。
①FLS3
②129/GFP ES
③CTS1
④FES1
⑤FES2
ただし、⑤のブルー部分は①②③④とは違っているのにred rectanglesで囲われています。特に6、12番染色体にはブルー部分が全くない。
また、red rectangles内ではないが、その下に置かれている以下の細胞の同じ6、11、12番染色体は①②③④⑤とは全くブルー部分の位置が違う。
⑥ntESG1
⑦ntESG2
①②③④⑤⑥⑦のブルー部分というのは同じ岡部マウスコロニーから選ばれていて、④⑦の凍結された2005年当時には<2011年当時の岡部マウスコロニーにあった何らかの種類の129の飛び込み痕>の元であるコンタミ痕が既に別の場所に現れていて、2011年当時にはそのどれかのラインが又近交化された結果が①②③④に現れていて、⑤のみは2005年当時の違う配偶子、もしくは2005年当時以降2011年当時までの間のどこか違う時期のマウスの持っていた配偶子のコンタミ痕が現れているのだと分かる。
2023/04/05 URL 編集
その前提であると、大田受精卵ESの作成された6年後には再度近交化されている129X1が若山さんによって選ばれて岡部マウスとの間でメイティングされた結果FLS3=CTS1=129/GFP ESになったことになる。これらの3つの細胞には<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>はありません。同様にFES1にもありませんから、このFES1はFLSであり得ると主張しているわけです。
この大田ESに関してはGOF ESと違って中身の洗い出しは不要です。GOF ESのラベルは小保方さんの筆記体記載ですからチューブをラベルごと残さないといけませんから、中身の入れ替えだと推測しているわけですが、大田ES4細胞に関しては、大田さんが京都大学で解凍して、細胞復活後に自分の分と先生に渡す分とに分けて凍結し、又ラベル書きして、自分の分は保管し、先生には宅配したわけです。到着は2014/7/1です。先生はそれを又解凍して東北大の黒木准教授や東大屋に送ったのですからチューブもラベルもその都度新たになっている。
和モガ説の批判から、我々はFES1は先生がFLSをFES1とラベリングしたものだと考えたが、ではどうしてFES2はFLSではないのかという新たな疑問にぶつかったわけです。FES2はFLSの<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>のあるサブストックだったのだとすることはできません。なぜなら、129X1コロニーは6年間の間に再度近交化されていて、新たな固定SNPs分布になっている筈だからです。20世代は4年でしたよね。
2023/04/05 URL 編集
桂報告書が援用していることになっている日経サイエンスの大田氏の証言によれば、FES1とFES2は同時期に大田氏によって同じマウスコロニーから選ばれたペアマウスの受精卵から作られたES細胞です。彼は129+Terのコロニーから選んだと思っていたが、検査結果がX1だと聞いて、自分の勘違いだったのだろうと言ってますから、実際には129X1のコロニーから選んだということになるわけです。
<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>はこの129X1のコロニーから選ばれたペアの持っていた配偶子である二つのエッグと二つのスペルムのいずれかにあったことになるわけです。
この<129+Terにあって129X1にはないB6のマウスコンタミ痕>のある129X1のコロニーは、2005年から2011年までの6年間のその間に再びマウスの飛び込み事故が無ければ、再度近交化してしまっていることに気づかないといけませんよね。又新たな129のラインに置き換えられたということもありません。なぜなら、129X1という系統のジャクソン研究所でのマウスコンタミ痕がそのまま残っているし、既にジャクソン研究所では名前が変えられていますが、報告書では名前もX1のままに書いているので2005年当時から自家飼育維持されているものです。
2023/04/05 URL 編集
Ooboeさんが興味をしめされましたね。有難うございます。私も今考えているところです。自分のブログでもここまで深入りはしていないです。では続きです。
FES1とFES2のSNPs解析に両者の間で異なるマウスコンタミ痕がある原因を考えている途中ですが、ここでBCA報告論文の当該文章の全体をもう一度示しておきましょう。今下線部で立ち止まっているところです。
**********
>>
After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded, the remaining 1,290 SNP alleles that distinguish FES1 and FES2 are supposed to have accumulated at or after establishment in 2005. Regarding these SNPs, STAP cell lines FLS3 and CTS1 and 129/GFP ES cells are nearly identical, but differ slightly from FES1 (at 30% of these alleles), suggesting that STAP cell lines FLS and CTS were derived from a sub-stock of FES1 ES cells.
親の不均一性を反映する上記の3つのSNPクラスターを除外した後、FES1とFES2を区別する残りの1,290のSNP対立遺伝子は、2005年の確立時または確立後に蓄積したと考えられる。これらのSNPに関しては、STAP細胞株FLS3とCTS1および129 /GFP ES細胞はほぼ同一であるが、FES1とはわずかに異なり(これらの対立遺伝子の30%)、STAP細胞株FLSおよびCTSがFES1 ES細胞のサブストックに由来することを示唆している。
**********
2023/04/05 URL 編集
興味深いですね、、、
私の考察が、途切れたままになって、まったく
進んでませんが、少し時間ができました。
この居士さんの考察
仮定ながら興味深いですね、、、
❝ではここでFES1、2の中身の入れ替え問題に関して、仮に先生が入れ替えたとして、どうしてFES1にはFLSを入れたのに、FES2には違う細胞、つまりntESG1、G2の129+Terとのマウスコンタミ痕のある細胞を注入したのかということです。たった今、中身の細胞の洗い出しの不徹底による混合ではないと和モガ説を批判したところです。どうして先生はどちらにも同じFLSのサブストックを入れなかったのだ。❞
この入れ替え事案ですが、
横浜理研、遠藤氏のアクロ発見時点
2014年6月25日前後の流れの中で
現在改めて、整理し直して、考察中です。
いろいろヒントをありがとうございます。
前から、引っかかっているのが、
パトナーへの理研の不可解な回答です。
なぜ、こんな回答になったのでしょうか?
★FES1、ntESG1は山梨若山研から取り寄せ
★FES2,ntESG2は若山研、以外の別の所から
取り寄せました。
しかし、東北大、東大はパトナーに
これら4サンプルは、まとめて、山梨若山研から
取り寄せた。と文書で
回答されているのですから、
ならば理研も、山梨若山研から
この4サンプル、まとめて取り寄せました。
と、パトナーに回答するのが普通となるところ
この普通の流れの回答とは、
なぜ、ならなかったのでしょうか?
変な理研の回答!こんな変な回答になった
事情に究明ヒントがありそうです。
山梨若山研では、FES1,と2,ntESG1と2
の4サンプルを解凍、増殖させて、
用意できていたのですから、
東北大、東大に送付出来た訳です。
山梨若山研には4サンプルが用意出来ていたのに
理研にはなぜ、4サンプルセットでなく
FES1,とntESG1の、2サンプル
だけを送付したのか?!
入れ替えトラブルがあったから???
など、興味つきませんね。
2023/04/05 URL 編集
釣りです。んじゃ。
2023/04/04 URL 編集
⑩FES2 ESと⑪ntESG1、⑫ntESG2の間にはピンク部分の共有がある。これが超難問でしたね。
と書きました。
入れ替えがあったという私の推測はこの大田ESの方から推論されたものでは無くて学生のGOF ES=GLS1だというBCA報告の証明から推論されている。以前以下の様に書いた。
>>
**********
同様にGLS=GOF ESであり、AC129とFLS-T=「僕のマウス」ES-1だと証明しているのであって、噂しているのではありません。
①入れ替えが無かったら小保方さんが犯人なのだし
②入れ替えがあったら先生か犯人だ
と分かっているのです。
2023/03/27 URL 編集
**********
この点は押さえておかなければいけないので入れ替えが無かったら「小保方さんがポトリ」なんです。なんだかどちらの立場でも心情的な判断からこの点を自分で曖昧に自己欺瞞したがる人達が多いですが、私は、先生も小保方さんも赤の他人なので、どちらに心情的に与する感情も持っていない。私の判断は単に合理的な判断に従っているだけで、それが事実なら「小保方さんがポトリ」であって困ることももありませんね。私はそれは事実でないと判断しているだけです。
ではここでFES1、2の中身の入れ替え問題に関して、仮に先生が入れ替えたとして、どうしてFES1にはFLSを入れたのに、FES2には違う細胞、つまりntESG1、G2の129+Terとのマウスコンタミ痕のある細胞を注入したのかということです。たった今、中身の細胞の洗い出しの不徹底による混合ではないと和モガ説を批判したところです。どうして先生はどちらにも同じFLSのサブストックを入れなかったのだ。
2023/04/04 URL 編集
2023/04/04 URL 編集
FES1、2もFLSも細胞です。FES1を完全に洗い出してFLSのサブストックに入れ替えたとしましょう。そしてFES2の洗い出しが不完全で元の細胞が幾分残った上にFLSのサブストックが注入たれたと考えているのが和モガさんの推測です。
理由はFES2とntESG1、G2に共通のピンク部分があるからでしたよね。
ntESG1、G2の129は+Terです。和モガさんも私もFES1、2の129は大田氏本人の最初の記憶通り129+Terだと推定している。しかし、私はこの和モガさんの如何にもありそうな説明には同意できていません。どうも納得できないんですね。
というのも細胞には全DNAが存在している。元の大田FES2細胞が幾分残ったままにその中にFLSサブストック細胞が混ぜられる。二つのDNAが存在していて、これをPCRにかける時に全て断片化される。実際には次世代シーケンサーを使って全解析されているわけですが、PCRの基本原理は同じです。
洗い出したのなら残されているDNAが少なく、追加注入されたDNAが多いわけです。全解析は断片化したDNA量も測定している。均等に大田FES2のDNA断片が並べられ、均等にFLSサブストック細胞のDNA断片が並べられる。すると解析結果は一部の染色体の特定領域だけ一方の細胞DNAの全部になることはありません。
和モガさんは混ぜられた細胞のDNA全解析という概念の意味と、染色体の一部領域に別の細胞のDNAの特徴が混じってるという概念の意味を混同してしまったのだと思います。
個々には混ぜられているから共有部分が残ったのだ
2023/04/04 URL 編集
今釣りに忙しいのであちらの往診には行けませんが、学さんの書かれていることから伺えるのはSNPsという概念は自然交配によって生じる現象ですから、前提として自然淘汰があって、生存に不適当な変異を受けてしまった個体は死んでしまったり、子孫に遺伝子を受け渡せなかったりして、この世には存在し得なくなる変異があるということの分からないお爺さんが居そうだなということですね。
DNAの並びにはエキソンと呼ばれる蛋白質製造に関与している部分と、まだその働きがよくわかっていないが進化の過去に出来てきたらしいが現在は蛋白質製造には関与していないとされているイントロン部分とがあることが分かっていて、蛋白質製造に関与しているエキソン部位はコーディング・リジョンと呼ばれ、そうでないイントロン部位はノン・コーディング・リジョンと呼ばれている。その切れ目はどこで分かるのかというと、基本に戻って、コドンと呼ばれる三個一組の塩基の並びで開始コドンはAUG、終始コドンはUAG、UGA、UAAですから、これらの開始コドンと終始コドンに挟まれている部位がエクソンで、そうでないコドンは途中にどれだけあってもアミノ酸指定コドンとは認識されないのでRNAには転写されずに切り捨てられるイントロン部位だということになる。
で、このエクソン部位が所謂遺伝子と定義づけられていて、ここに突然変異が生じると或るアミノ酸を指定しているコドンが別のアミノ酸指定コドンに変化してしまうので致死原因になったり、奇形原因になったりするので、これを正しく修復する機能も別途あるのですが、一塩基変異が特に害のないものである場合はそのまま残って所謂個性を形成するわけです。
対して、DNAの大半であるイントロン部位はアミノ酸指定されていないので変異が残ったままでも生存には関係しないので、修復もされずにそのまま世代を受け継がれて、染色体の乗り換え交叉の生じる配偶子形成を介してあちこちの個体に分割継承されていくわけです。
近交系マウスはその中のたまたま最初の作製研究所によって選ばれたたった1つがいの雌雄マウスが持っていたSNPsが近親交配によってどちらかのホモに固定されているもので、そのSNPsが登録されているということがBCA報告論文のSNPs解析結果を理解するための最低条件であるわけです。
BCA報告書の本文とその解析グラフ表はマウスの自然交配を前提にマウスコンタミ痕を追跡している結果報告になっている。
①129X1のジャクソン研究所での既に全世界中の研究者に公的に知らせられているB6のマウスコンタミ痕
②それ以外の場所に散見される129X1の理研若山研でのB6のマウスコンタミ痕
③129+Terの理研若山研でのB6のマウスコンタミ痕
④岡部Acr-CAG共挿入B6マウスへの大阪大岡部研、もしくはその後の理研若山研での129X1のマウスコンタミ痕
最期の④が、<After the above three SNP clusters reflecting parental heterogeneity are excluded>と書かれている文章の中の< three SNP clusters reflecting parental heterogeneity>という言葉の意味で、レジェンドに示されている<red rectangles>の中のブルー領域の話なのです。
現在学さんとの間で私に言わせると"焦って"議論されているらしいお話はこのSNPs解析の基本を離れた後の細胞の培養変異の話ですから、また自然界のSNPsの話と、その近交化による登録SNPsの話とも違う話ですよね。
2023/04/04 URL 編集
さあ、そういうことがPCR結果として出て来得るものなのかどうか。
釣りです。んじゃ。
2023/04/03 URL 編集
対して私はそこになかなか踏み込まない。
大前提として、
①FLS3---2012年に先生が作成した細胞(「僕のマウス」F1を渡したと先生は言うが、岡部マウスとのF1ではなかったという証拠は提出されていない。)
②CTS1---FLSと同様の背景で同様のやり方で作成されている細胞を単にFgf4培地でTS-likeに先生が誘導したもの。(従って、FLSとCTSのDNA配列は同じであるが、RNA発現解析結果は異なっていておかしくない。)
③FES1---大田氏が2005年のntES論文アクセプト後の時期に、論文とは無関係に受精卵ES細胞を作ったが、研究に使うことなく2005/12/7に凍結したとされている細胞で、本人は129+Terで作製したと思っていたが、調査結果は129X1だったので自分の記憶違いだったのかと日経サイエンスに証言している。(因みに2005年のntES論文に使われたのは129+Terです。論文アクセプト直後にFES1,2を作製している。)
④129/GFP ES---小保方さんのボックスに他の後にそう命名されたFLS関連細胞と共に並んでいた中の一つの細胞で、コンプライアンス室で何回かのリスト作成後、小保方さんが再現実験参加のために病院から出勤してきた際に、竹市、松崎、丹羽、片山氏の立会いの下で細胞の内容の説明をしたときには、ES-likeという意味の命名なのだという説明以外に、特段これに関して何のコメントも無かったもので、別途知らない細胞については不明と答えていたが、後に、この細胞に関して特定して質問された時には、他のラボメンバーと同様に「知らない」と答えた細胞である。(「この細胞からアクロシンがでてESコンタミが疑われるが、あなたは知っているかという類の誘導質問であると、これは犯人であっても無くても「知らない」と答えるので、竹市、松崎、丹羽、片山氏4者立会いの下での質問に対する回答と違っていておかしくはない。)
ということで、これらの細胞に関して、2014/6/5の和光本部でのテレビ会議で竹市氏が「細胞の出所が分からなくては特定の結論を導き出すことはできない」(佐藤貴彦『SSTAP細胞 事件の真相』79P)と注意したにも関わらず、上述の様に由来確認されないままに細胞の比較だけが行われている結果になっていて、先に紹介した北村弁護士の述べている<証拠能力>に関する一般常識すらない、遅れた村社会リンチ魔女狩りの結果が桂報告書とBCA報告論文となってしまっているわけです。
4細胞の作製順序などというペテン論理に入る前に、既に知られている細胞の性質を検討する方が先なのだということは一般人の普通の感覚です。
2023/04/03 URL 編集
染井吉野は花吹雪した後に葉が出ます。葉と一緒に咲くのは山桜で、敷島の大和心を人問はば朝日に匂ふ山桜花、と宣長が歌ったように、樹木の背後から太陽の光が透かして射しこんできたときの崇高な美しさに下りの山道で踏んでいたブレーキの足の力が抜けて、山側の土手に衝突しそうになり、家族ごと事故してしまいそうになった昔を思い出します。それにしても谷側でなくてよかった。
山桜は一般に染井吉野より開花が早いですから、これはピンクの色の濃い種類で葉と一緒にかわいらしく咲いているところから河津桜に似ている気がします。
2023/04/03 URL 編集
学さん
書かれてはいかがですか・・・
2023/04/03 URL 編集
Re: 初めまして
このような内容のコメントをいただいたのは初めてです。
大変、感激しました。
出版状態を維持するには結構、コストがかかるため、残念ですが、今は絶版となっています。
私の人生で初めての自主出版本で、多分、最後になると思います。
乏しい私の人生経験を軸に小説を書いたにすぎないので、今さら、自分で読む気もしない位うまく書けておりませんでした。
しかし、ブログを始めて後、ため息ブログにとりつかれて、学とみ子は以前と比べて、いくらか世の中を学びました。
人の気持ちもいろいろ考えるようになりました。
小保方氏のキャリアの挫折は本当に気の毒と思っています。
ため息ブログからのいやがらせは続くと思いますが、今後もよろしくお願いいたします。
コメント、本当にありがとうございました。
2023/04/02 URL 編集
初めまして
私は主人公と同年代にあり、共感する場面がいくつもあります。主人公が苦しみながらも心身共に立ち直って行く姿にとても感動しました。私自身悩みが多い中、この本が心の支えの1つとなっています。この本に出会えたことが嬉しく、どうしても感謝の気持ちをお伝えしたくてコメント欄に書かせていただきました。ありがとうございました。
先生の溢れる知性と強靭な精神力を尊敬しています。これからも頑張ってください!
応援しています。
2023/04/02 URL 編集