Lさんコメント 10月4日バージョン2

万能細胞 iPS ES STAP
[ L ]
2018/10/4() 午前 2:54
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サイエンスの査読者の最大の誤解は、STAP細胞はモノクローナルでキメラに寄与すると思い込んでいた事です。ポリクローナルな細胞塊の形で胚盤胞に注入した事を強調して論文に記載していれば、このような誤解は避けられたかもしれませんが、一方で、ポリクローナルである事は多能性の証明においてかなりdisadvantageなので、Natureに通すためにはあまり強調できなかった面もあったのでしょう。何れにせよ、論文の書き方としては相当巧み(NHKの番組では、阪大の仲野先生が、「手練れ」と表現されてました)ですが、本来ならば論文記載の仕方ではなく、データの質で勝負すべきだったと思います。本庶先生はこの辺を気になさっていたのではないかと思いますよ。削除
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万能細胞 iPS ES STAP
[ L ]
2018/10/4() 午前 2:54
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アルイミさんのFACSソートのコメントですが、「97%の純度」と言った場合は、最終的に分離された細胞の純度になります。抗原ごとの純度ではありませんので、二種類の抗原を組み合わせても、1/1000の純度にはなりません。例えば、採取した組織サンプルから血液細胞と血管内皮細胞を除去するためにCD45(血液マーカー)とCD31(内皮マーカー)でダブル染色し、CD45-CD31-の非血液、非内皮細胞をソートで分離したとしても(ちなみにこの分離は一回の染色でできますが、二回繰り返しても良いです)、その純度は97%、すなわち3%は血液あるいは内皮の細胞が混じっているという事です。前述のように、PCRの感度は高いので、このコンタミ率は無視できません。ソートのコンタミは、CD45ソートでSTAPを作った場合にも問題になります。ちなみに、アルイミさんの言う「ダブルポジティブ」というのは、レパトア解析やクラススイッチの話ではないと思いますよ。例えば、単純にB細胞マーカーのCD19T細胞マーカーのCD3で二重染色して、ソートでこれらの細胞を取り除くような実験をイメージしていると思います。削除
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万能細胞 iPS ES STAP
[ L ]
2018/10/4() 午前 2:54
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ホストT細胞の混入はこの実験系の問題点の一つ(もう一つはD2J2再構成T細胞の脾臓での頻度)で、やっぱりさんのコメントは言い過ぎと思います。ほとんどの組織は血液から酸素供給を必要とし、血管が入り組んでいます。よって成体マウスの組織採取では、混入する血管内のT細胞由来TCR を検出する可能性が高く、混入T細胞を完全に除去するプロセスを挟む必要があります。おそらくフローサイトメトリーを用いた手法になりますが、その純度の問題は次のアルイミさんへのコメントで書きます。よって、ホストT細胞の混入を防ぐためには、Rag-KONOG-SCIDなど、T細胞がないマウスをホストとして用いる、あるいは発生学的にホストT細胞ができる前段階(例えば、検証実験でキメラ解析された胎生10日あたりであれば、ホストのT細胞はまだできてない時期と思われます)での解析が必要になります。特許の2NキメラでのTCR再構成 実験でどんなサンプルを用いたものか不明ですが、もし胎生10日のキメラサンプルであれば、 非特異増幅でないことをシーケンスで確認できれば、データとしての意味があったでしょう。削除
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万能細胞 iPS ES STAP
[ L ]
2018/10/4() 午前 2:53
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いくつか提案したい事がありますので、書いてみます。未承認で構いませんが、学さんから皆さんに、何らかの形で伝えていただけると幸いです。

最初に、京大(当時は横浜理研)の河本先生の、胎児胸腺細胞におけるTCRb再構成追跡の論文
ttp://www.jimmunol.org/content/jimmunol/179/6/3699.full.pdf

を見て下さい。Double negative (DN) T細胞の培養系を用い、TCRb再構成の多様性を追跡しています。DN1DN2の細胞を、シングルセルから培養して増やすと、その間にTCRb再構成がランダムに起き、多様な再構成パターンが見られる事が、PCRを用いた網羅的なD1J1及びD2J2の再構成検出により示されています。「ポリクローナル」な細胞集団の多様な再構成パターンを、PCRである程度 網羅できる事を示しています。PCRの場合、増幅サイクルを増やしたり、増幅プロセスを2段階にする事により、再構成されたTCRが1コピーでもあれば検出可能(理論的には)ですから、モノクローナルである必要はないです。 削除

 
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